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ISSN 0582-9879 Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2003, 35(12): 1077－1082 CN 31-1300/Q

Effects of Oleate on ATP Binding Cassette Transporter A1 Expression and Cholesterol Efflux in THP-1 Macrophage-derived Foam Cells

TANG Chao-Ke, YANG Jun-Hao, YI Guang-Hui, WANG Zuo, LIU Lu-Shan, WAN Zai-Yang, YUAN Zhong-Hua, RUAN Chang-Geng, YANG Yong-Zong*

( Institute of Cardiovascular Disease of Nanhua University, Hengyang 421001, China )

Abstract To study the effect of oleate on ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1) expression and cholesterol efflux in THP-1 macrophage-derived foam cells, after exposure of the cultured THP-1 macrophage-derived foam cells to oleate for different time, cholesterol efflux was determined by FJ-2107P type liquid scintillator. ABCA1 mRNA and its protein level were determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The mean ABCA1 fluorescence intensity of THP-1 macrophage-derived foam cells was detected by flow cytometry. The results showed that oleate markedly inhibited ABCA1-mediated cholesterol efflux from THP-1 macrophage-derived foam cells. This was accompanied by a reduction in the membrane content of ABCA1. Oleate did not alter ABCA1 mRNA abundance, indicating that decreased ABCA1 transcription, enhanced mRNA decay, or impaired translation efficiency did not account for these inhibitory effects. Oleate, however, increased ABCA1 turnover when protein synthesis was blocked by cycloheximide. Oleate reduces cholesterol efflux and the level of ABCA1 protein in THP-1 macrophage-derived foam cells.

Key words ATP binding cassette transporter A1; flow cytometry; cholesterol; low density lipoprotein

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Received: July 8, 2003 Accepted: September 18, 2003

This work was supported by the grants from the Special Funds for Department of Science and Technology of Hunan Province (No. 01SSY1003)

*Corresponding author: Tel, 86-734-8281288; Fax, 86-734-8281288; e-mail, yzyang@mail.hy.hn.cn

油酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达和胆固醇流出的影响

唐朝克 杨峻浩 易光辉 王 佐 刘录山 万载阳 袁中华 阮长耿 杨永宗*

( 南华大学心血管病研究所, 衡阳421001 )

摘要 以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象, 观察油酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达的影响, 以探讨油酸对动脉粥样硬化发生发展的影响。 用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出, 高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、 游离胆固醇和胆固醇酯含量, 运用逆转录多聚酶链反应和Western 印迹分别检测ABCA1 mRNA 与ABCA1蛋白的表达, 采用流式细胞术检测细胞平均ABCA1荧光强度。 实验显示油酸引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、 游离胆固醇与胆固醇酯呈时间依赖性增加, 而ABCA1蛋白水平、 细胞平均ABCA1荧光强度以及apoA-I介导的胆固醇流出呈时间依赖性减少, 细胞内胆固醇增多, 但ABCA1 mRNA没有明显变化。 结果表明, 油酸减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白水平, 降低细胞内胆固醇流出, 增加细胞内胆固醇聚积。

关键词 三磷酸腺苷结合盒转运体A1; 流式细胞术; 胆固醇; 低密度脂蛋白

动脉粥样硬化（atherosclerosis, As）性心血管疾病是糖尿病患者发病和死亡的主要原因。 II型糖尿病病人脂质代谢紊乱, 包括血浆甘油三酯升高和高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）降低[1]。 HDL降低是心血管疾病的主要危险因素, HDL代谢异常在增加与糖尿病相关联的动脉粥样硬化中起重要作用。

HDL通过提高清除动脉壁巨噬细胞过多胆固醇而抗As。 三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP binding cassette transporter A1, ABCA1）介导细胞内胆固醇和磷脂转运到无脂HDL[2]。 ABCA1基因突变导致Tangier病（Tangier disease, TD）。 TD是一种严重的HDL缺乏综合征。 HDL缺乏导致组织中巨噬细胞存积大量的胆固醇, TD病人有As形成[3]。 因此, 与糖尿病相关联的因素可能影响脂质代谢途径的活性, 导致动脉壁巨噬细胞胆固醇堆积和As形成。

巨噬细胞胆固醇负荷过高结果明显地增加ABCA1 mRNA和蛋白质表达, 以转运出过多的胆固醇。 肝X受体和视黄酸类X受体(liver X receptor / retinoid X receptor, LXR/RXR)可以调控ABCA1; 并且cAMP类似物也可激活ABCA1的转录。 胆固醇代谢与脂肪酸代谢之间存在一种联系, 即固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein, SREBP）。 SREBP可调节固醇、 脂肪酸合成和脂蛋白胆固醇吸收的相关基因[4]。 固醇和脂肪酸分别或一同反馈抑制SREBP, 而且LXR固醇配体可激活ABCA1和SREBP-1c的转录。 脂肪酸可拮抗这些配体[5]。

II型糖尿病的脂质异常表现之一是脂肪酸升高。 As病变处的巨噬细胞产生脂蛋白酯酶, 脂蛋白酯酶能从甘油三酯中释出脂肪酸。 巨噬细胞产生的脂蛋白酯酶能致As。 糖尿病时脂蛋白酯酶增加[6]。 因此, 糖尿病病人巨噬细胞暴露于异常高的脂肪酸和其他代谢紊乱中。 脂肪酸包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸, 油酸是不饱和脂肪酸之一, 并且是血浆中最多的一种脂肪酸。

本文以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象, 观察油酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响, 以便探讨油酸在As发生发展中的作用。

1 材料和方法(Materials and Methods)

1.1 仪器和试剂

流式细胞仪(Coulter epics altra HyperSortTM system, 美国), PE公司200型高效液相色谱仪, CP100MX超速离心机(Tokyo, Japan), FJ-2107P液体闪烁计数器(国营二六二厂); THP-1人单核细胞由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库提供; 逆转录多聚酶链反应试剂盒为美国Promega公司产品; 油酸、 放线菌酮、 牛血清白蛋白(BSA)、 载脂蛋白A-I(apoA-I)、 佛波酯(phorbol myristate acetate, PMA)、 乙腈、 胆固醇为Sigma公司产品; 总RNA提取试剂盒(Trizol)为上海生物工程公司产品; ABCA1和GAPDH(作为内参)引物均由上海生物工程公司合成; 羊抗人ABCA1一抗和FITC标记的兔抗羊二抗(Santa Cruz公司), 辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗 (博士德公司, 武汉)。 其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 低密度脂蛋白的分离、 修饰及鉴定

健康人血浆购自衡阳市血站。 按我们以前的方法[7]制备低密度脂蛋白, 将210 mL血浆置超速离心机作序列超速离心。 提纯的LDL在含 200 μmol/L 乙二胺四乙酸的BPS液中透析48 h, BCA法定量蛋白质, 用PBS液调节蛋白质浓度至1 g/L, 并进行修饰及鉴定, 过滤除菌, 4 ℃保存。

1.3 细胞培养

THP-1单核细胞用含有10%小牛血清RPMI 1640培养液, 37 ℃、 5% CO2培养箱中静置培养。 培养液中加青霉素和链霉素各1.0×105 IU/L, 在每次实验前用160 nmol/L佛波酯培育THP-1细胞24 h, 诱导使其分化成巨噬细胞。 巨噬细胞在50 mg/L 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)中培育48 h, 使细胞转变成泡沫细胞。

1.4 胆固醇流出

胆固醇流出检测按文献[8]描述的方法进行。 THP-1巨噬细胞用0.2 mCi/L [3H]胆固醇和50 mg/L ox-LDL及含有10%小牛血清RPMI 1640培养液共同培育48 h之后, 用PBS液洗涤细胞, 加200 mmol/L 油酸和含2 g/L牛血清白蛋白RPMI 1640培养液培育细胞不同时间。 再用PBS液洗涤细胞, 在无血清含10 mg/L载脂蛋白A-I新培养液中培育细胞12 h, 用闪烁计数法检测培养液和细胞的[3H]胆固醇。 胆固醇流出率=(培养液cpm值÷总cpm值)×100%, 其中总cpm值=(培养液cpm值+细胞cpm值)。

1.5 油红O染色和脂质染色的半定量分析

将细胞培养于放有消毒盖玻片的6孔培养板内, 细胞被处理后, 用PBS洗3次, 50%异丙醇固定1 min, 油红O染色液染色10 min, 苏木素染色5 min, 1% HC1分色及返蓝后, 水性封片剂封片。 显微镜下观察, 细胞内脂质呈红色, 细胞核呈蓝色, 图像分析系统收集图像并于显微镜下摄像。 按Wada等[9]的方法进行脂质染色的半定量分析即根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。 如果细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“－”; 细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”即为油红O染色细胞。 每一块玻片计数100个细胞。

1.6 高效液相色谱分析

按我们以前描述的方法进行[10]。 取样品10 μL进行高效液相色谱分析。 采用C18柱, 以异丙醇∶正庚烷∶乙腈为流动相进行非梯度洗脱, 流速1 mL/min, 柱温保持4 ℃, 216 nm检测12 min。 以峰面积定量胆固醇, 单位为mg/g细胞蛋白质; 胆固醇酯经胆固醇酯酶水解, 测总胆固醇量, 总胆固醇量减去游离胆固醇量为胆固醇酯的量, 以mg/g细胞蛋白质为单位。

1.7 流式细胞术

按文献[11]方法, 各组细胞经4%多聚甲醛室温下固定30 min, 再用含1%小牛血清的PBS洗三遍, 每次5 min, 加入含1%小牛血清、 1.5% ABCA1一抗的PBS, 置室温60 min, 含1%小牛血清的PBS洗三遍, 1∶200加FITC标记的兔抗羊二抗, 室温避光反应30 min。 胰酶消化细胞, 含1%小牛血清的PBS洗三遍后, 移入测试管, 上机检测细胞平均荧光强度。 阴性对照不加FITC标记的兔抗羊二抗,代之以小鼠IgG。 避光30 min后用流式细胞仪检测。 每份标本收集10 000个细胞进行检测。

1.8 逆转录聚合酶链反应

THP-1巨噬细胞（1×107个细胞/瓶）在含有50 mg/L ox-LDL培养液中培养48 h, 然后用无血清培养液加200 mmol/L 油酸培养细胞, PBS液洗涤细胞, 用10 mg/L apoA-I继续培养细胞12 h, 收集各组细胞。 按Trizol试剂盒说明书提取总RNA。 取2 μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA, 再取10 μL逆转录产物进行PCR循环。 94 ℃温育5 min, 94 ℃变性1 min, 60 ℃复性1 min, 72 ℃延伸1 min, 共34个循环, 末次循环72 ℃, 延伸10 min。 ABCA1(GenBank序列号: AF285167)的引物序列:上游5′-GCTGCTGAAGCCAGGGCATGGG-3′; 下游5′-GTGGGGCAGTGGCCATACTCC-3′。 PCR扩增产物长度为306 bp。 GAPDH的引物序列:上游5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′, 下游5′-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′。 PCR扩增产物长度为697 bp。 反应结束后, 取反应产物10 μL进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, UVP型凝胶图像分析系统摄图, 并分析各组目的基因及GAPDH基因灰度值, 以二者的比值代表ABCA1的表达。

1.9 Western 印迹检测ABCA1蛋白表达

在收获好的细胞中加入三去污剂裂解缓冲液进行细胞裂解, 于4 ℃离心10 min, 弃除沉淀, 用BCA法进行蛋白质定量。 取50 μg蛋白质加入2×SDS凝胶加样缓冲液中, 在100 ℃加热10 min以使蛋白质变性。 用6% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离, 转PDVF膜, 丽春红染色观察转移效果, 并确定蛋白质分子量标准位置。 封闭液封闭2 h, 按1∶200加入羊抗人ABCA1一抗, 4 ℃培育过夜, TBST洗三次, 1∶2000加入辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗, 室温培育1 h, TBST洗三次, 用Western印迹荧光检测试剂盒显示于X光片。 结果用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描, 以对照组的面积灰度值为100%与实验组进行比较和半定量分析。

1.10 统计学处理

实验所得数据采用均数±标准差(x±s)表示, 两组间比较采用方差分析及t检验, P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果(Results)

2.1 THP-1巨噬细胞源性泡沫化

用50 mg/L氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)与THP-1巨噬细胞共同培育48 h。 THP-1巨噬细胞经油红O染色, 显微镜下观察, 发现细胞质内有大量的脂滴存在, 符合泡沫细胞形态特点(图1)。 同时用高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、 游离胆固醇与胆固醇酯均明显增加, 与巨噬细胞比较均有显著性差异(P<0.05), 其中细胞内胆固醇酯从48 mg/g蛋白质剧增到383 mg/g蛋白质, 说明细胞内有大量胆固醇酯聚集, 胆固醇酯/总胆固醇之比值达到60%以上, 已为泡沫化细胞(图2)。

Fig.1 Oil red O staining of THP-1 macrophage-derived foam cells	Fig.2 The chromatography picture of cholesterol and cholesterol ester in THP-1 macrophage-derived foam cells identified by high performance liquid chromatography

2.2 油酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的影响

THP-1巨噬细胞与 50 mg/L ox-LDL 共同培育48 h后, 加200 mmol/L 油酸培育0 h、 6 h、 12 h和24 h。 油红O染色, 显微镜下观察, 细胞内脂滴随培育时间逐渐增多增大, 到12 h、 24 h时明显地增多变大。 油红O染色细胞分别为(46±5)、 (51±6)、 (74±8)、 (78±9)个。 12 h、 24 h时分别与0 h时比较油红O染色细胞数明显地增多(P<0.05)。 高效液相色谱分析THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇、 游离胆固醇与胆固醇酯均明显地增加, 12 h、 24 h时分别与0 h时比较均有显著性差异(表1)。

Table 1 Effects of oleate on the level of total, free and esterified cholesterol in THP-1 macrophage-derived foam cells

Time (h)	Total cholesterol (TC)	Free cholesterol (FC)	Cholesterol ester (CE)	CE/TC (%)
0	523±65	195