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http://www.abbs.info E-mail: abbs@sibs.ac.cn ISSN
0582-9879 Acta
Biochimica et Biophysica Sinica 2003, 35(12): 1099－1104 CN 31-1300/Q |
Cloning,
Expressing and Functional Analysis of SjMF4, a Novel Schistosoma japonicum Gene
ZHANG
Liang, CHENG Guo-Feng, FU Zhi-Qiang, JIN Ya-Mei, FENG Xin-Gang, YUAN Chun-Xiu,
CAI You-Min, LIN Jiao-Jiao*
( Shanghai Institute of Animal
Parasitology, the Chinese Academy of Agricultural Science, Shanghai 200232,
China )
Abstract Based
on the phenomenon of the natural anti-schistosomiasis in Microtus fortis, the
sera from normal Microtus fortis were employed to immunoscreen the cDNA library
of adult Schistosoma japonicum (Chinese strain), two positive clones were
obtained, RACE technique was further applied to amplify one of the clones, and
a cDNA fragment with an ORF was identified. Sequencing revealed that it was a
novel gene of Schistosoma japonicum, and it was named SjMF4 (Schistosoma
japonicum Microtus fortis 4). Then the structure and functional motifs of SjMF4
were analysed. The gene was subcloned into pET-28a(+) vector; the recombinant
protein showed good antigenicity in Western blotting. The gene was further
subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct the DNA vaccine
containing SjMF4. Immune experiments in mice showed significant protection that
the recombinant plasmid did induce 28.64%±3.82%
worm reduction and 21.73%±3.98% egg reduction than
controls against the Schistosoma japonicum cercaria challenge.
Key
words Microtus fortis;
Schistosoma japonicum; SjMF4; protection
____________________________________________
Received:
June 9, 2003 Accepted:
September 29, 2003
This
work was supported by a grant from Shanghai Science and Technology Development
Foundation (No. 20014909002)
*Corresponding
author: Tel, 86-21-54082675; Fax, 86-21-54081818; e-mail, caassp@public.sta.net.cn
血吸虫新抗原基因SjMF4的克隆、表达及功能分析
张亮 程国锋 付志强 金亚美 冯新港 苑纯秀 蔡幼民 林矫矫*
（
中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所、农业部动物寄生虫学重点实验室, 上海 200232 ）
摘要 根据东方田鼠天然抗日本血吸虫病的现象, 首次利用东方田鼠健康血清结合羊抗小鼠IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA表达型文库, 获得两个阳性克隆,
采用RACE技术对其中一cDNA片段进行扩增,
获一含ORF的基因片段。 序列分析表明该基因为一日本血吸虫新基因, 命名为SjMF4（Schistosoma
japonicum Microtus fortis 4, SjMF4）。 利用ExPASy的ScanProsite软件对此基因编码的蛋白质结构和功能域进行了分析。 把该基因克隆到原核表达载体pET-28a(+), Western印迹显示表达产物具有良好的抗原性。
又构建了真核表达质粒pcDNA3-SjMF4重组DNA疫苗,
小鼠实验表明可诱导一定的保护作用。
关键词 东方田鼠; 日本血吸虫; SjMF4; 保护作用
日本血吸虫(Schistosoma
japonicum)感染引起的血吸虫病是一种严重危害人畜健康的寄生虫病[1]。
其终末宿主广泛, 包括7个目28个属的40余种哺乳动物。 但野外调查及人工感染皆表明, 日本血吸虫不能在东方田鼠（Microtus fortis）体内正常发育及生存[2]。
东方田鼠血清被动转移实验、体外抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent
cell-mediated cytotoxicity, ADCC）试验均表明体液免疫在东方田鼠抗血吸虫病中发挥了重要的作用, ELISA试验表明东方田鼠血清中存有天然抗血吸虫的抗体, 其中抗血吸虫IgG3抗体明显高于其他鼠种[3～6]。
本研究利用东方田鼠健康血清, 结合辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG3抗体免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA表达型文库,
以获得可能与东方田鼠抗日本血吸虫病相关的日本血吸虫靶抗原编码基因, 并进行了基因表达及核酸疫苗研究。
1 材料和方法（Materials
and Methods）
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和酶 联苯二胺(DAB)购自上海生工生物工程有限公司; 硝酸纤维素膜为浙江台州市路桥四甲生化塑料厂产品; 牛血清白蛋白（BSA）购自上海华美生物公司;
HRP-羊抗小鼠IgG3为美国Caltag公司产品;
总RNA提取试剂盒Trizol及DEPC,
Silver bead DNA快速纯化回收试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。 5′-RACE试剂盒购自Gibco
BRL公司。 Super script II RNase H－反转录酶购自Gibco BRL公司。
Taq plus I DNA聚合酶购自上海生工生物工程有限公司。 限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindIII购自TaKaRa生物工程（大连）有限公司。 T4 DNA连接酶购自Promega公司。
1.1.2 菌种、质粒、文库及实验动物 pBluescript II SK(+)、pcDNA3、pET-28a(+)及大肠杆菌Y1090、BL21由本所提供,
pGEM-T easy 克隆载体购自Sigma公司; 噬菌体λZiplox
为Life Technologies公司产品; 日本血吸虫成虫cDNA文库由本所构建; 东方田鼠（洞庭湖种群,
雄性, 8周龄, 约200
g）由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供; 新西兰大白兔（雄性,
2.5～3.0 kg）、昆明系小白鼠(雄性,
6～7周龄, 约50
g )购自中科院上海分院实验动物中心; 日本血吸虫中国大陆株尾蚴由本所钉螺室提供; 日本血吸虫成虫为尾蚴人工腹部贴片感染新西兰大白兔（3000条/只）,
感染42天后肝门静脉冲虫, 液氮冻存备用。
1.1.3 主要仪器 高速低温台式离心机系Sigma公司产品;
图像分析仪为Phamacia Biotech公司产品; 紫外分光光度计系美国惠普公司产品; DNA thermal cycler480系Perkin
Elmer公司生产; 恒温培养摇床为江苏太仓实验设备厂产品; 恒温培养箱为上海医疗器械七厂产品; Bio-Rad电泳仪、转移电泳槽系Bio-Rad Laboratories 公司产品。
1.1.4 RACE引物 引物是目的基因片段RACE特异的反向引物,
括号内的数字表示该引物在序列中的位置, 由上海基康生物技术有限公司合成:
GSP1,
5′-GGTTCATAGTGTTCTGA-3′ (750－767);
GSP2,
5′-GGAGCCTTTCAGACCGTGGTACA-3′(444－467);
GSP3,
5′-CGACGTGCGCTTCTATAGTT-3′(366－386);
GSP4,
5′-GGCTATGCGAGTACCCTGAGTT-3′(159－181)。
1.2 方法
1.2.1 免疫筛选日本血吸虫 成虫cDNA表达文库利用东方田鼠的健康血清结合羊抗小鼠IgG3抗体对日本血吸虫中国大陆株的成虫cDNA文库进行免疫筛选[7], 其中东方田鼠血清按1∶10稀释,
羊抗小鼠IgG3以1∶1000倍稀释。 获得的阳性克隆由上海基康生物技术有限公司测序。
1.2.2 基因的克隆 （1）总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫成虫200 mg, 按Trizol 试剂盒说明书进行总RNA的提取。
（2）应用5′-RACE扩增目的基因按5′-RACE
试剂盒说明书介绍的方法操作, 以日本血吸虫总RNA为模板,
以GSP1基因特异性引物反转录合成该基因5′端cDNA,
用RNA酶去除模板RNA后,
转录产物经GlassMax柱纯化, 用末端转移酶在其3′端加上poly（dC）尾。 然后分别以GSP2、GSP3、GSP4为下游引物, 以5′-RACE试剂盒提供的锚定引物为上游引物进行巢式PCR, 扩增目的基因。
1.2.3 PCR产物的克隆和重组质粒的构建 将目的基因PCR产物用Sliver beads DNA 回收试剂盒进行回收。 PCR产物用BamHI和HindIII进行酶切,
再与相同酶切的pBluescript II SK(+)载体进行连接, 并转化大肠杆菌TGI。
经测序鉴定后, pBluescript II SK(+)-SjMF4用BamHI和HindIII酶切分离目的基因, 克隆到表达质粒载体pET-28a(+)。
阳性克隆再用Sanger双脱氧核糖核酸末端终止法进行测序鉴定, 由上海基康生物技术有限公司完成。
1.2.4 融合蛋白质在大肠杆菌中的表达 经测序鉴定的重组质粒用限制性内切酶BamHI和HindIII分离目的基因, 克隆到表达质粒载体pET-28a(+),
经酶切及测序鉴定后, 转化到BL21大肠杆菌表达,
将阳性克隆接种到3 mL LB培养基（含Kan 50 IU/mL）中, 37 ℃培养过夜。 按1∶100的比例接种到另一根LB（含Kan）培养基管, 37 ℃快速振荡培养至细菌生长对数期A600到0.6～1.0时,
取1 mL细菌培养液, 离心去上清液,
加入1 mL新配制的LB（含Kan）培养基。 取100 μL 按1/100的比例加入到10 mL LB（含Kan）培养基中, 37 ℃摇床培养3
h。 加入IPTG,
使其终浓度为1 mmol/L, 37 ℃快速振荡培养, 分别在加入IPTG后0、2、4、6、8和10
h取出1 mL细菌培养物,离心进行SDS-PAGE电泳（聚丙稀酰胺分离胶浓度12％,
浓缩胶5%）观察表达时相变化。
1.2.5 融合蛋白质抗原性的检测 将高表达时相菌体蛋白质进行SDS-PAGE电泳, 转移到NC膜上,
用5%脱脂奶粉/PBS室温封闭2
h后, 再用pET-28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白质吸附处理过的日本血吸虫成虫抗原免疫小鼠血清作一抗, 室温作用2 h, 加入HPR-羊抗小鼠IgG3, 室温作用1
h, 再以二氨基联苯胺作为底物显色。
1.2.6 SjMF4基因的编码蛋白质的结构和功能域分析 采用ExPASy的ScanProsite软件进行结构和功能域分析[8]。
1.2.7 SjMF4基因核酸疫苗的研制 把SjMF4基因与真核表达质粒pcDNA3重组, 对酶切鉴定和PCR鉴定阳性克隆进行测序分析, 确定读码正确后进行阳性菌的扩大培养, 抽提、纯化重组质粒DNA。
1.2.8 小鼠DNA免疫和保护试验 设实验和对照二个组, 一组接种重组真核表达质粒pcDNA3-SjMF4,
另一组接种pcDNA3质粒DNA。 每组15只昆明系小鼠,
每只小鼠以100 μg腿部外侧肌肉注射进行首次免疫, 2、4周后分别同法同量加强免疫。 6周后, 每只小鼠用(40±2)条尾蚴进行攻击感染,
12周后, 剖杀动物, 门静脉灌洗冲虫收集成虫,
计数。 取肝脏2
g, 剪碎后用8% KOH (20 mL)消化, 60 ℃ 水浴4～6
h, 取100 μL消化液在显微镜下记数。
用以下公式计算减虫率和减卵率(EPG为平均每克肝组织中所荷虫卵数):
1.2.9 数据分析 根据差异显著性检验的t检验进行减虫率和减卵率数据分析。2结果（Results）
2.1 SjMF4全长基因的克隆
经免疫筛选血吸虫cDNA文库和二次亚克隆, 获得两个阳性克隆,
应用RACE技术对其一阳性克隆SjMF4进一步扩增,
获一约900 bp的cDNA片段,
测序表明该基因片段长871 bp, 开放阅读框为780 bp, 编码259个氨基酸(图1),利用NCBI的Blast软件对其序列进行同源性搜索, 结果与血吸虫其他已知基因无显著同源性, 是一新基因。
Fig.1 Nucleotide sequence and presumed
amino acid sequence of SjMF4 gene
*
means stop codon.
2.2 PCR产物的克隆和重组质粒的构建
pBluescript II SK(+)-SjMF4用BamHI和Hin-dIII酶切分离目的基因, 克隆到表达质粒载体pET-28a(+)相应酶切位点。 经BamHI、HindIII酶切鉴定（图2）和测序鉴定正确后, 构建成重组表达质粒pET-28a(+)-SjMF4（图3）。
|
|
|
|
Fig.2 Identification
of recombinant plasmid by double digesting M,
DNA marker 2000; 1, pET-28a(+)-SjMF4 cut with BamHI and HindIII. |
Fig.3 The
recombinant expression plasmid pET-28a(+)-SjMF4 The
gene of SjMF4 was cloned into pET-28a(+) vector containing promoter T7, and
the recombinant expression plasmid was named pET-28a(+)-SjMF4. |
2.3 SjMF4基因在大肠杆菌中表达
将SjMF4基因克隆到pET-28a(+)中,
酶切及测序鉴定无误后, 通过IPTG诱导表达,
融合蛋白质分子量大约为35 kD。
收集不同时相的产物, 进行SDS-PAGE电泳(图4), 结果表明诱导2
h已达到最高表达时相。
Fig.4 SDS-PAGE analysis of the
expression products of pET-28a(+)-SjMF4 in E. coli
M, marker; 1, 2, 4, 6 and 8,
pET-28a(+)-SjMF4 induced with IPTG for 0, 2, 4, 8 and 10 h; 3, 5, 7 and 9,
pET-28a(+) induced with IPTG for 2, 4, 8 and 10 h. Arrow means expressed
recombinant protein of SjMF4.
2.4 表达产物抗原性的鉴定
以重组表达产物进行SDS-PAGE电泳, 经电转移至NC膜上, 用经pET-28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白质吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫血清作一抗进行Western印迹检测, 结果在35
kD处有一明显的识别条带(图5箭头处),
表明重组表达产物具有良好的抗原性。
Fig.5 Western blot analysis of
recombinant fusion protein probed with the mouse serum immunized with S.
japonicum adult worm antigens
M,
protein marker; 1, pET-28a(+) expressing product; 2, pET-28a(+)-SjMF4
expressing product (as arrow pointed).
2.5 SjMF4基因编码蛋白质的结构和功能域分析
同源性分析表明SjMF4基因编码蛋白质的23～223氨基酸区段与核糖体蛋白3A家族有60%同源性, 理论分子量29
kD。 利用PSort和TMpred进行在线分析,
结果表明此蛋白质不存在信号肽和跨膜区。 利用ExPASy的ScanProsite软件又进行SjMF4基因的结构和功能域分析, 表1为所预测的SjMF4基因编码蛋白质的结构和功能位点。
Table 1 Analysis of structure and functional motifs of SjMF4
|
Name of site |
Number |
Site in sequence |
Sequence of A.A. |
|
cAMP- and cGMP-dependent PKP site |
2 |
7–10 18–21 |
KKvT KKkT |
|
Protein kinase C phosphorylation site |
4 |
26–28 75–77 150–152 159–161 |
SkK SeK SeR TtR |
|
Casein kinase II phosphorylation site |
5 |
26–29 70–73 120–123 178–181 246–249 |
SkkE SlgD StiE StcD SrpD |
|
N-myristoylation site |
3 |
12–17 54–59 103–108 |
GGkkGG GTriAS GLelTR |
|
Amidation site |
2 |
12–15 16–19 |
Ggkk GGKK |
2.6 SjMF4基因核酸疫苗的研制
pET-28a(+)-SjMF4用BamHI和EcoRI酶切分离目的基因, 克隆到真核表达质粒载体pcDNA3相应酶切位点。 经测序鉴定正确后, 构建成重组表达质粒pcDNA3-SjMF4（图6）。
Fig.6 The recombinant plasmid
pcDNA3-SjMF4
The
gene of SjMF4 was cloned into pcDNA3 vector containing promoter T7, and the
recombinant expression plasmid was named pcDNA3-SjMF4.
2.7 SjMF4基因核酸疫苗的动物保护试验
实验组和对照组小鼠攻击感染血吸虫尾蚴后均存活。
从表2可看出, pcDNA3-SjMF4重组质粒免疫小鼠平均虫荷数为17.13条,
质粒pcDNA3免疫组的虫荷数为24.27条,
减虫率为28.64%; 免疫组小鼠平均每克肝组织含虫卵数7258.49个, 对照组为9370.11个, 减卵率为21.73%。
两者都显著降低(P<0.05)。
Table 2 Worm and egg counting reduction rate induced by
pcDNA3-SjMF4 in mice
|
Groups |
Average worm burden |
Worm reduction rate (%) |
EPG |
Egg reduction rate (%) |
|
Control group |
24.27±5.40 |
|
9370.11±2020.43 |
|
|
Experiment group |
17.13±4.46* |
28.64±3.82 |
7258.49±787.6* |
21.73%±3.98 |
Values were represented as 
±s(n=30). *P<0.05 vs. control group.
3 讨论(Discussion)
东方田鼠为我国血吸虫病流行区广泛分布的鼠种, 早在五、六十年代就发现其对日本血吸虫病具有天然的抵抗力, 东方田鼠血清被动转移和血清体外杀伤血吸虫试验均表明东方田鼠血清在抗血吸虫病现象中发挥重要作用[3,4]。
东方田鼠血清补体灭活处理后对日本血吸虫童虫的杀伤作用降低[4]。
进一步的血清抗体研究表明东方田鼠血清中IgG3抗体在抗日本血吸虫中可能发挥重要作用[5]。
东方田鼠健康血清中存在有较高水平的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原的IgG3亚类抗体, 其A值是抗BSA的31倍, 而Balb/C小鼠血清为1.7倍[6]。
东方田鼠天然血清中白细胞介素-4（IL-4）含量显著高于昆明鼠天然血清[9], IL-4是由Th2细胞分泌的一种细胞因子, 可诱导B细胞分化, 并诱导单核-巨噬细胞表达MHC-II类抗原,
最终提高东方田鼠机体的免疫应答机能。由于东方田鼠血清在抗日本血吸虫病中发挥作用重要。 有几家实验室利用东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库,
以期获得东方田鼠血清针对的血吸虫靶抗原, 为发展抗血吸虫病疫苗提供新思路。 利用东方田鼠天然血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,
曾获得三磷酸甘油醛脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、22.6 kD膜相关蛋白质、副肌球蛋白、细胞色素C及组织蛋白酶B等7种蛋白质的编码基因片段[10]。 王庆林等[11]又利用感染日本血吸虫的东方田鼠血清从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选到3个新基因, 其中一个为编码胞液氨基肽酶。
氨基肽酶是一类催化氨基酸从蛋白质或多肽分子的氨基酸解离的酶类, 在各种生物体内广泛分布, 对蛋白质和各种生物活性多肽的成熟和代谢发挥重要作用。 同时将此基因克隆到pGEX-5X-3载体中, 利用表达的融合蛋白质进行动物保护实验, 减虫率达26.57%[12]。
一系列研究表明东方田鼠抗日本血吸虫病的作用可能是东方田鼠血清中含有某些能破坏日本血吸虫体被膜的物质, 血吸虫的体被膜被破坏后, 使某些血吸虫重要的抗原表位暴露, 从而为东方田鼠体内的免疫系统能有效的发挥对血吸虫的免疫杀伤作用提供可能。 因此,
利用东方田鼠的健康血清筛选抗血吸虫病的候选抗原具有潜在的重要意义。
本研究根据体液免疫可能在东方田鼠抗日本血吸虫病中发挥重要作用, 而IgG3抗体在此抗病中可能扮演关键角色的最新研究成果, 采用东方田鼠的健康血清结合羊抗小鼠IgG3抗体对日本血吸虫成虫cDNA文库进行免疫筛选,
获得2个基因。 其中SjMF4基因经生物信息学初步分析表明其编码产物与核糖体蛋白3A家族有60%同源性。 对SjMF4基因的结构和功能域进行分析, 结果表明此基因编码的蛋白质多处具有cAMP和cGMP依赖性的磷酸化位点,
蛋白激酶C磷酸化位点, 酪蛋白激酶II磷酸化位点和酰胺化, 肉豆蔻酰化修饰等,
提示SjMF4基因的编码产物可能在血吸虫核糖体中的信号转导, 辅助信号传递等功能中发挥重要作用。 SjMF4基因核酸疫苗的动物保护实验诱导了28.64%减虫率, 21.73%减卵率,
表明此基因具有作为血吸虫候选疫苗的潜能。 对该基因的编码蛋白质作为抗血吸虫病疫苗侯选抗原值得深入研究。
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at: 2003-12-16