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ISSN 0582-9879                ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(4): 391-395 CN 31-1300/Q

Short Communication

Preparation of Liposome Containing Bacteriorhodopsin with Natural Preferred Orientation of Its Transient Photoresponse

HUANG Li, MING Ming, LIU Jia, LIU Jian, LI Qing-Guo¹, DING Jian-Dong*

( Department of Macromolecular Science, Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers, Fudan University, Shanghai 200433, China; ¹ Department of Physiology and Biophysics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China )

Abstract Bacteriorhodopsin is a membrane protein of halobacteria and functions as a light-driven protein pump. After we isolated bR from cultured halobacteria, bR was mixed with amphiphilic DPPC under different pH. The liposomes were formed after sonication. The remaining biological activity of bR as a proton pump was then verified and pulsed-light-induced proton movement was detected, while liposomes were observed via TEM and light scattering. Although there was no noticeable difference in morphologies of both vesicles formed at pH=2.5 and pH=7.0, the orientations of bR in both liposomes were found to be opposite under these two conditions. This experiment confirmed that the protein bR, when self-assembling into liposomes under acid medium, kept the similar orientation as in the natural plasmid membrane. Such a “normal” orientation was, however, different from most of reports in the literature about liposomes prepared under normal neutral conditions.

Key words bacteriorhodopsin; membrane protein; self assembly; liposome

Received: December 9, 2002 Accepted: January 27, 2003

This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No. 29825109, No. 20174006), the Award Foundation for Young Teachers from Ministry of Education, the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program)(No. G1999054306-03), the National High Technology Research and Development Program of China(863 Program) (No. 2001AA215451), and Science & Technology Developing Foundation of Shanghai (No. 02DZ11010)

*Corresponding author: Tel, 86-21-65643506, 65642531; Fax, 86-21-65640293; e-mail, [email protected]

“正常”膜蛋白取向的细菌视紫红质脂质体制备及其瞬态光学响应

黄力 明明 刘嘉 刘坚 李庆国¹ 丁建东*

( 复旦大学高分子科学系、聚合物分子工程教育部重点实验室, 上海200433; ¹复旦大学生命科学院生理学与生物物理学系, 上海200433 )

摘要 细菌视紫红质(bR)是嗜盐菌质膜上的一种跨膜蛋白质, 有其独特的光驱质子泵功能, 可以被定向组装到磷脂脂质体膜上, 并且表现出和细胞膜上相反的取向。 通过细菌培养和细胞膜分离, 获得了含bR蛋白质的紫膜悬浮体系, 在pH=2.5时将bR悬浮液和两亲性的DPPC磷脂混合、通过自组装的方式形成了含bR膜蛋白的磷脂脂质体, 并通过瞬态光学响应测量考察了bR的取向和质子泵生物活性。 结果表明, bR膜蛋白可以被整合到DPPC的脂质体膜上; 蛋白质的质子泵运行规律的测量进一步验证了在酸性条件下所制备的脂质体上bR保持了不寻常的择优取向, 与细胞膜上的“正常”取向一致, 而与绝大多数文献报道的中性条件下制备的脂质体质子泵取向相反。

关键词 细菌视紫红质; 膜蛋白; 自组装; 脂质体

两亲性生物分子的有序化和自组装行为是一个重要的基础科学问题。 本研究的模型蛋白质为细菌视紫红质(bacteriorhodopsin, bR)。 这是存在于嗜盐菌(Halobacterium salinarium)紫膜上的跨膜蛋白质, 也是一种独特的光敏蛋白质, 其空间结构如图1所示。 当bR受到光照, 视黄醛分子发生异构化, 由全反构型(all-trans)变为13-顺型(13-cis), 并引发一系列热反应, 经过一系列中间态(其中, 通常以吸收峰为412 nm 的M中间体的寿命较长), 在约几十毫秒内又回复到基态, 从而形成一个光循环[1,2]。 伴随着光循环过程, 蛋白质分子发生了一系列构象变化, 并调节了不同基团的pKa值, 在N端释放一个质子, 而在C端接受一个质子, 即相当于将一个质子由细胞质传输到细胞膜外侧, 在膜的两边产生质子梯度。 这就是所谓的光驱质子泵功能[3]。 需要提到的是, 在天然紫膜中bR蛋白的N端总在细胞膜外侧, C端在胞内侧[1～4]。

Fig.1 The seven trans-membrane α-helix structure of bR molecule

60年代中期以来, 脂质体技术在推动生物膜的研究进展中作为模式系统起着非常重要的作用。 脂质体可以定义为一个由双亲的磷脂分子组成的微细囊泡结构, 有时囊泡膜上还可能嵌有膜蛋白, 如图2所示。 一般, 亲水基团处于囊泡的内外壁, 亲脂基团处于中间。 膜壁厚度大约为5～7 nm, 囊泡直径为25～500 nm左右。 脂质双层的结构是由磷脂分子的特殊性质决定的。

Fig.2 Schematic presentation of liposome containing membrane protein with different preferred orientation

根据文献报道, 在中性条件下膜蛋白bR与磷脂所形成的脂质体上, bR有与天然膜上相反的取向[4,5], 即蛋白质的C端在脂质体膜外侧, 而N端位于膜内侧; 来自动物视网膜的视紫红质蛋白体外整合到脂质体也有类似的结果[6]。 目前还不清楚是什么原因决定了bR及视紫红质蛋白在膜上的取向。 bR在脂质体上的这种“反常”取向为大量文献所报道, 但是“正常”取向的报道却极少。 我们以前也报道了在正常的中性条件下所制备的“反常”取向的含bR蛋白的鸡蛋卵磷脂(EPC)脂质体[7]。

在本文中我们采用振荡加超声的技术, 最后通过离心的方法得到脂质体[8]。还通过实验证实了酸性条件下制备的磷脂脂质体上的bR有着类似天然细胞膜上的“正常”取向, 进一步通过自制的仪器探测了bR脂质体悬浮液在脉冲光照下的响应动力学过程。

1 材料和方法(Material and Methods)

1.1 主要实验材料

bR蛋白是按照常规方法从自行培养的嗜盐菌株R1M1中分离提取[7,9]; pH敏感染料pyranine(8-hydroxy-1,3,6-pyrenetrisulfonate)购自Kadak公司; 所用二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC)为Sigma公司产品。

1.2 在酸性条件下含bR蛋白的DPPC脂质体的制备

在酸性条件下脂质体的制备过程与中性条件下脂质体的制备方法基本相同[7]。 简要说来, 用氯仿与甲醇(体积比2:1)的混合溶剂溶解DPPC磷脂(约10 g/L)。 取1 mL溶液置于50 mL圆底烧瓶中, 在N2流下使溶剂蒸发, 使磷脂在瓶底铺成一薄层。 最后加无水乙醚清洗, 以除去残余的溶剂。 将bR蛋白样品约3 mL(蛋白质和磷脂摩尔比大约为1:15左右)用15 mL 0.1 mol/L的 NaCl水溶液稀释后, 用超声仪处理, 超声工作15 s, 间隔30 s, 共进行4×3次。 将已经超声处理的bR溶液用1 mol/L的HCl溶液调为pH=2.5后, 将溶液倒入圆底烧瓶中, 加入小玻璃珠在涡旋振荡器上振荡15 min, 使脂质充分水化, 形成多层脂质体。 此时液体呈十分浑浊的状态。 用超声处理上述液体： 超声工作15 s, 间隔30 s, 共进行4×3×2次(处理时, 样品置于冰浴中, 超声仪输出功率为200 W), 可发现液体比处理前清澈。 此时, 即形成了含bR蛋白的单层和多层脂质体。 离心去除脂质体中的杂质： 用69 000 g离心上述样品1 h, 弃去上清液, 其中应主要包含未与bR结合的脂球; 将沉淀用0.1 mol/L NaCl稀释后用1 mol/L 的NaOH溶液调回pH至中性, 31 000 g离心25 min, 弃去沉淀(其中主要含未与脂结合的bR碎片), 该上清液即为我们所要的含bR蛋白的DPPC脂质体。

1.3 测试方法及仪器

样品的吸收光谱由UV-260型紫外－可见分光光度计测量。 中间体M产物随时间的衰减过程以及在一个光循环中的质子跨膜运输的动力学过程可由自制的毫秒级动力学光谱仪跟踪记录, 具体光谱仪构造见文献[1０]。 在本装置中采用了照相闪光灯, 其脉冲半宽小于1 ms, 脉冲作用光使被研究的样品产生光化学反应, 另一束分析光为250 W溴钨灯, 并连接单色仪用来检测光化学反应过程中样品在某一波长的光密度变化。 在计算机上通过一个自行设计的软件读取波形存贮器中的采样数据, 并以后缀名*.wsv将数据以ASCII格式存盘, 可用数据处理软件Origin直接导入。

2 结果和讨论(Results and Discussion)

2.1 透射电镜和散射仪观测

用铜网粘取一点脂质体溶液, 用镊子将铜网放入磷钨酸溶液中染色5 min, 用以加深背景(负染), 随后进行透射电镜观测(可选择20 000倍到150 000倍), 结果见图3; 并通过动态激光散射仪检测脂质体粒径。 两个独立实验均证明确实形成了纳米粒子(一般来说, 对于多分散体系, 光散射所测粒径大于电镜结果)。 在酸性条件下的脂质体电镜图片及粒径分布与在中性条件下制备的脂质体(数据未显示)并无明显差别。 当然, 上述实验手段尚不能证明蛋白质已经被整合到脂质体膜上以及蛋白质尚有生物活性。

Fig.3 Observation of DPPC liposomes containing bR

(A) TEM and (B) dynamic laser scattering. The fed molar ratio of DPPC to bR was 15 :1.

2.2 脂质体中bR的基本光学活性

采用自制的毫秒级动力学光谱仪来检测包含在磷脂中的bR的质子泵活性和取向。 它的基本原理是利用两道相互垂直的光路来测量光反应发生后体系中的吸收变化(一道为瞬态的激发光源, 使样品发生光化学反应的波长在蛋白质的吸收峰568 nm附近; 另一道为持续的检测光源)。 我们首先将持续的探测光波长选择为412 nm, 观察了在脉冲光激发之后中间体M的变化, 如图4所示。 结果表明, 脂质体中具有bR的光学特征, bR被提取并整合到脂质体之后, 仍具有光学活性(以下动力学光谱测量得到的所有数据均为重复实验3次后取平均的结果)。

Fig.4 The decay curve of photo-intermediate M412 of DPPC-liposomes containing bR formed at pH=2.5 and detected at neutral pH

2.3 脉冲光照引起的瞬态pH变化

上述测量尚不能说明bR在脂质体膜上定向组装。 事实上, bR蛋白在直流电场下定向沉积[11,12]是完全可以预见的, 但是在脂质体上通过自组装也能发生择优取向则是一个学术界目前为止尚无法解释的现象。 本文也只是报道了具有“正常”取向的含bR脂质体这一实验结果。 如果在脂质体上的bR有择优取向且保留了其质子泵功能, 则光照后介质中的pH会发生变化。 为此我们采用水溶性的pH敏感染料pyranine来探测磷脂中的bR的质子泵活性和取向。 持续的检测光源的波长选择为pH敏感染料的吸收峰458 nm; 此时, M中间体基本无吸收, 也不干扰测量。 在该波长下, 当介质碱化, 染料的吸收增加, 即A458的吸收变化值为正。 这将作为判别介质pH变化的依据。

光照引起瞬间pH变化的测量结果见图5。 图5(A)中的光脉冲引起的曲线2为在脂质体悬浮液中加入染料后光脉冲引起的吸收变化, 而曲线1为不加染料时的体系中的吸收变化, 曲线2减去曲线1后的差值曲线即为图5(B)中的曲线2, 它反映了介质中光脉冲引起的pH变化。 A458吸收变化值为负说明： 酸性条件下制备的脂质体的质子泵取向是使介质酸化的。 而所有文献表明, bR发挥质子泵功能时总是从N端泵出质子。 可见在酸性条件下制备的脂质体中, bR的N端倾向于朝向脂质体膜外, 而C端则倾向于朝向膜内, 表现出择优取向。

Fig.5 Flash-induced absorption change of DPPC-liposomes containing bR formed at pH=2.5 and detected at neutral pH

(A) Absorption response before (curve 1) and after (curve 2) adding the pH sensitive dye pyranine; (B) the resultant difference absorption curve (curve 2) and that from the control experiment (curve 1), which corresponds to DPPC liposomes without bR.

中性环境(pH=7.0)中形成的含有bR蛋白的卵磷脂脂质体曲线如图6所示, 在此体系中光脉冲主要引起介质的碱化, 说明在这种脂质体中, 大部分bR的C端指向脂质体外侧, 从而光照导致接受质子 (DPPC中性条件下制备的结果与之类似, 也为使介质碱化的过程, 数据未显示)。

Fig.6 Flash-induced absorption change of EPC-liposomes containing bR formed at pH=7.0

(A) Absorption response before (curve 1) and after (curve 2) adding the pH sensitive dye pyranine; (B) the resultant difference absorption curve.

从图5和图6中我们可以看出, 中性条件下形成的脂质体受光照后, 质子由脂质体外向脂质体内部泵入; 而对于酸性条件下形成的脂质体, 介质首先呈现酸化, 表明质子由脂质体内向外部介质泵出。 有文献报道[1３]在酸性条件下紫膜释放和吸收质子的先后顺序会颠倒。 但本文讨论的是蛋白质的取向问题而非时间顺序问题; 此外, 我们在酸性条件下制备的脂质体在测量时已经重新调回中性pH, 故本文报道的意义与文献[13]等不同。

本文的结果尚不能够解释为什么bR在酸性条件下形成的脂质体中质子泵取向相反的现象, 甚至不能解释蛋白质为什么在自组装的过程中发生择优取向? 但是从bR在脂质体膜上的取向受制备时的pH影响可以预料, 脂膜上的电荷分布或bR的电荷分布对于蛋白质在膜上的自组装可能有重要作用。

References

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收稿日期： 2002-12-09 接受日期： 2003-01-27

国家自然科学基金资助项目(No. 29825109, No. 20174006)、教育部高等学校优秀青年教师教学和科研奖励基金、国家重点基础研究发展规划项目(973计划)资助项目(No. G1999054306-03)、国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(No. 2001AA215451)和上海市科学技术发展基金资助(No. 02DZ11010)

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