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ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(6): 495-502
CN
31-1300/Q |
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Review |
The Biological Characteristics of SARS Virus and Its Related Coronaviruses
WANG Cheng-Zhong, CHI Cheng-Wu*
( 1Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institute of Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China )
Abstract Cases of the life-threatening respiratory disease with no identified cause (designated as “severe acute respiratory syndrome”, SARS, in March 2003) were first reported in late 2002 from Guangdong Province, China; they were followed by reports from about other 30 countries (or regions) such as Vietnam, Singapore, Thailand, Hong Kong (China), Canada, and USA etc. Because of its ongoing epidemic and high death rate, SARS has shined an intense spotlight all over the world. The World Health Organization (WHO) has promptly established a network of international laboratories consisting of 13 members around the 10 countries to facilitate the identification of the causative agent of SARS. A novel coronavirus, SARS virus, fulfilling all of Koch's postulates was announced to be the primary aetiological agent of SARS on April 16 by WHO shortly after the Canadian scientists released the full-length genome sequence of SARS virus (Tor2) on April 12. China is now facing a formidable task to fight SARS. In this article, we present a brief summary on the biological characteristics of coronavirus with its associated diseases, and make some suggestions on how to curb this outbreak and how to cure SARS disease based on the potential targets of this novel virus.
Key words SARS; atypical pneumonia; virus; coronavirus; biological characteristic; treatment
Receivd: May 15, 2003 Accepted: May 19, 2003
*Corresponding author: Tel, 86-21-54921165; Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]
SARS病毒及相关冠状病毒的生物学特征
王承忠1,2 戚正武1*
( 1中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031;
2复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系, 上海 200032 )
摘要 重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）, 临床表现为非典型肺炎。 2002年底我国广东发现此种当时不明病因的疾病, 此后在越南、中国香港、加拿大、美国等三十多个国家和地区也相继发现类似病例。 由于SARS具有很高的传染性, 死亡率也高, 各国和世界卫生组织（WHO）对此病高度重视。 WHO迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。 一种新型的冠状病毒(coronavirus)被认为极可能是SARS的病原体, 因为它满足了6个科赫要点(Koch's postulates)。 2003年4月12日, 加拿大科学家首次公布了SARS病毒Tor2的基因组序列。 4月16日, WHO正式确认 SARS病毒是SARS的病原体。 目前我国SARS的病情仍然十分严峻, 现就SARS病毒及相关冠状病毒的生物学特征和可能的药物防治靶点作一综述。
关键词SARS； 非典型肺炎； 病毒； 冠状病毒； 生物学特征； 治疗
重症急性呼吸综合征（SARS）传染性强且死亡率相对高, 引起了世界各国的高度重视。 一种新型的冠状病毒(coronavirus)满足了6个科赫要点(Koch's postulates), 极可能是SARS的病原体[1～4]。 2003年4月12日, 加拿大科学家首次公布了SARS病毒Tor2的基因组序列。 4月16日, WHO正式确认 SARS病毒是SARS的病原体[5]。 目前SARS病情仍然十分严峻, 世界各国正努力研究SARS病毒的生物学特征和可能的药物防治靶点及疫苗。
1 冠状病毒简介及其结构特征
冠状病毒科（Coronaviridae）成员为单链RNA病毒, 在分类学上它们与动脉炎病毒科(Arteriviridae)同属于巢病毒目(Nidovirales)。 目前所知, 它们只侵染脊椎动物, 并与人类和动物的许多疾病有关；自1980年在德国召开第一届国际冠状病毒讨论会以来, 日益受到医学、兽医学和分子生物学家的广泛重视。 这类病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性, 特别是鼠肝炎病毒JHM毒株可以引起小鼠的脱髓鞘性脑脊髓炎, 是研究人类多发性硬化病(multiple sclerosis)的良好模型[6]。 冠状病毒mRNA的转录机制又为分子病毒学家提供了另一种RNA拼接机制, 而且它还是一个很好的外源基因的表达系统[7, 8]。 根据其基因组和抗原性特征[5], 冠状病毒可大致分为三类：第一类来自猪等动物[如猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、 人冠状病毒229E]； 第二类来自牛、鼠等动物[如牛冠状病毒、小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus, MHV)、人冠状病毒OC43]； 第三类来自鸡等禽类[如火鸡蓝冠病毒（turkey bluecomb virus）、鸟类传染性支气管病毒（avian infectious bronchitis virus, IBV)]。 人类的冠状病毒种类比较多, 分别属于第一类和第二类。 引起普通感冒的病毒中有20％属于冠状病毒, 主要有229E和OC43两个抗原型, 但普通感冒症状较轻, 因此不像目前的“非典”病毒引人注目。 冠状病毒感染分布于全世界各地区, 在我国以及英国、美国、德国、日本、俄罗斯、芬兰、印度等国均已发现冠状病毒的存在。 此类病毒对温度很敏感, 因而所引起的疾病流行多发生在冬季和早春季节。 冠状病毒也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病原体, 目前冠状病毒的感染尚无特异性治疗和预防手段。
冠状病毒为正义单链RNA病毒, 复制不经过DNA中间体。 其基因组是已知的RNA病毒中最大的, 约27～31kb。 依病毒株不同, 冠状病毒有3或4种结构性蛋白[9], 即刺突蛋白S（spike protein）, 膜蛋白M（membrane protein）, 小分子膜蛋白E（small membrane protein）, 核衣壳蛋白N（nucleocapsid protein）及血凝素酯酶HE(hemagglutinin esterase/acetylesterase)(图1)。 其中S蛋白是病毒外壳成分, 也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞性免疫反应的重要因子。 S蛋白属于I型膜蛋白, 在病毒的成熟过程中需经过翻译后加工, 如糖基化、被胰蛋白酶样蛋白酶切成S1和S2片段等。 S2片段藉跨膜区锚定于膜上, 而S1片段仅通过非共价键与S2片段连接。 S1片段主要参与病毒与宿主细胞间的识别, 而S2片段则在S1片段识别和结合宿主细胞受体后发生构象改变, 从而促进病毒与细胞的融合[10, 11]。 M蛋白是负责病毒颗粒组装的主要蛋白质, 属于Ⅲ型膜蛋白, 可分为：一个大的C端体内区（endodomain）, 三个穿膜片段和一个短的N端体外区（ectodomain）[12]。 E蛋白也是一种膜整合蛋白, 在病毒表面的数目相对较少, 由占全长2/3的高疏水性的N端(E蛋白的跨膜区)和一段伸向病毒体内的C端组成[13]。 HE仅在少数冠状病毒表面存在, 属I型糖蛋白, 含一段跨膜区和很短的体内区。 HE蛋白在成熟的病毒颗粒表面常以藉二硫键连接的同源二聚体形式存在, 可能与病毒所引起的病理有关[14]。
Fig.1 Structure of the coronavirus virion HCoV-OC43[9]
SARS病毒是SARS的元凶。 在加拿大科学家首次公布了SARS病毒Tor2的基因组序列后, 美国、中国香港、新加坡和中国北京等相继报道了相应SARS病毒株的基因组序列。 通过比较已知冠状病毒的基因组后发现[5,15], SARS病毒基因组结构与其他冠状病毒相似, 预测得到的主要蛋白质有RNA复制酶（复制酶1a, 1b）, S、M、E、N蛋白等, 但没有HE蛋白。 SARS病毒虽然外表与其他冠状病毒类似, 但从基因和蛋白质的同源性可以看出, SARS病毒明显不同于已知的其他三类冠状病毒群, 可能属于新的冠状病毒群, 其S、M和N蛋白与其他冠状病毒相对应的蛋白质在进化关系上接近, 但在某些区域与其他冠状病毒存在相当大的差异。 SARS病毒基因组中约有2／3与鼠类冠状病毒的相关基因有“远亲”关系, 另一部分则与鸟类冠状病毒的基因有些相似。
2 冠状病毒的生物学特征
2.1 病毒对宿主细胞的入侵
冠状病毒的S蛋白在病毒表面以三聚体形式存在, 是构成病毒表面冠状结构的主要成份, 也是病毒和宿主细胞受体结合并引起病毒包膜与细胞膜融合从而导致病毒入侵的主要结构蛋白[10]。 有些冠状病毒表面还有HE蛋白, 它也能与宿主细胞表面受体9-O-acetylneuraminic acid结合, 但就病毒入侵宿主细胞的要求而言, Ｓ蛋白是充足且必需的[11]。 S蛋白结构不同, 其相应宿主细胞上的受体也不相同。 它是决定冠状病毒对不同的宿主细胞嗜性的基础。 人氨肽酶N（hAPN）是人冠状病毒229E的S蛋白的受体[16], 而人冠状病毒OC43却利用细胞表面MHC I分子作为受体[17]。 APN是在肠、肺、肾等上皮细胞及神经细胞突触等处表达的细胞表面金属蛋白酶, 人冠状病毒229E对神经细胞和胶质细胞的侵染也是借助于S蛋白对APN的结合[18]。 APN催化活性中心的突变可导致其丧失对HCoV-229E的结合, 表明结合位点在催化活性中心内或附近, 但S蛋白与APN的结合过程似乎与此酶的活性无关。 可溶性受体hAPN可以阻止HCoV-229E病毒对宿主细胞的侵染。 如前所述, HCoV-229E病毒S蛋白与hAPN结合后构象发生改变, 从而促进了病毒与细胞的融合[19]。 对人横纹肌肉瘤细胞有很高嗜性的HCoV-OC43利用宿主细胞的MHC I分子作为受体, 干扰素γ能通过增强神经细胞MHC I的表达提高病毒对神经元的嗜性[20]。 小鼠肝炎病毒MHV则以癌胚抗原细胞粘附分子（CEACAM）作为受体[21, 22], CEACAM和MHC I分子同属于Ig超家族。 这些结果表明冠状病毒家族中不同成员, 其宿主细胞表面的S蛋白受体可以是相关联或无关联的。 如前所述, S蛋白识别和结合宿主细胞上的受体主要借助于其N端的S1片段, 如HCoV-229E的S1片段内的407～547残基序列对病毒结合hAPN是必需的[19]。 除了这种蛋白质-受体介导的细胞融合外, 冠状病毒在低温时还可直接以膜融合方式入侵宿主细胞。 冠状病毒对宿主细胞的选择性主要依赖于S蛋白的膜外区, 此区的改变常能改变病毒的宿主嗜性, 例如将不能侵染小鼠的猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的S蛋白膜外区用小鼠肝炎病毒MHV的S蛋白膜外区取代, 则重组的病毒（mFIPV）就获得了侵染小鼠的能力而不再侵染猫[23]。 一些已知冠状病毒进入宿主细胞的受体见表1。 干扰冠状病毒的表面蛋白与其宿主细胞上受体的相互作用能阻断病毒入侵宿主细胞, 因而针对这一靶点有望开发出有效的防治冠状病毒侵染的药物。
Table
1 The coronaviruses and their
receptors on host cells
|
Virus |
Viral
surface protein |
Host |
Receptor |
Reference |
|
bovine
coronavirus (BCV) |
spike
(S) |
bovine |
9-O-acetylneuraminic
acid |
10 |
|
Murine
coronavirus MHV |
spike
(S) |
mouse |
CEACAM |
21 |
|
HCoV-229E |
spike
(S) |
human |
aminopeptidase
N (APN) |
16 |
|
FIPV
and FeCV |
spike
(S) |
feline |
aminopeptidase
N (APN) |
58 |
|
TGEV |
spike
(S) |
porcine |
aminopeptidase
N (APN) |
59 |
|
HCoV-OC43 |
spike
(S) |
human |
MHC
I |
17 |
冠状病毒是一种有外壳的RNA病毒, 其入侵宿主细胞的方式有： 1. 受体介导的内吞, 这需要病毒表面S蛋白等识别并结合宿主细胞上的对应受体。 它们的相互作用引起宿主细胞内吞病毒颗粒, 并形成早期内吞体(endosome), 此过程可能同样需要成笼蛋白(clathrin)介导。 早期内吞体在宿主细胞内进一步与溶酶体融合, 通过酶解等作用裂解病毒颗粒, 将病毒的基因组RNA释放到胞内。 根据此过程对酸的敏感性又可分为：酸性依赖 (如TGEV, OBLV60)和非酸性依赖 (如MHV-4)[26]； 2. 病毒与宿主细胞膜的直接融合, 这也依赖于病毒表面S蛋白等对宿主细胞相应受体的识别。 上面已提及S蛋白以S1, S2片段分布于冠状病毒表面, 其中S1片段参与病毒-细胞间的识别和结合, 而S2片段含有三个α螺旋和一个融合活化区, 与病毒-细胞间的融合相关。 S1片段与宿主细胞上相应受体结合可诱导S2片段构象发生改变, 暴露出S2片段内的融合活化区而促进病毒与细胞膜的直接融合[27,28]。 有些冠状病毒对宿主细胞的侵染力对温度敏感, 这可能主要由于S1-S2片段间的结合力与温度有关。 还有些冠状病毒与宿主细胞膜的直接融合不需要S蛋白与其受体的识别, 这种融合常对周围pH敏感, 这可能由于S1-S2间结合力的强弱与pH有关, 此种融合可能在侵染后期促进病毒在宿主细胞间的直接播散和进一步侵染[29,30]。 有些冠状病毒能以多种方式进入宿主细胞。 病毒以不同方式进入细胞是一个病毒与宿主细胞间相互作用的过程, 依赖于两者表面不同分子间的相互作用。
2.2 病毒基因在宿主细胞内的表达, 蛋白质的加工和成熟
冠状病毒进入宿主细胞后, 利用宿主细胞内的元件来复制其基因组、表达不同的蛋白质, 并利用宿主或其自身的蛋白酶对病毒的基因和蛋白质前体进行加工。 冠状病毒的基因组为单链正义RNA, 结构特点为多顺反子（polycistron）, 5′和3′端含非翻译区, 有6～12个开放阅读框（ORF）。 冠状病毒的基因转录、翻译和翻译后加工很独特。 除基因组mRNA外, 冠状病毒基因转录的其余亚基因组mRNA间具有巢式（nested）结构特征和一段共同的3′端序列。 除最小的亚基因组mRNA外, 编码其余蛋白质的mRNA均包含自身的基因和其3′下游编码其他蛋白质的基因, 但因每个蛋白质的基因都有终止密码子的存在, 仅5′端的首个ORF才能被翻译[7,31,32]。 这些亚基因组mRNA的5′端均带有一段来自冠状病毒基因组5′最前端的保守引导序列(leader sequence), 这段引导序列对病毒基因的表达有很强的顺式作用[33]。 这些具有特殊结构亚基因组mRNA的产生是由冠状病毒的基因组所决定的, 这也为分子病毒学家提供了一种新的RNA拼接机制。 冠状病毒的结构蛋白分别由其基因组3′端的不同ORF编码翻译。 有些结构蛋白的成熟需要在高尔基体内加工和宿主蛋白酶的剪切, 病毒自身编码的蛋白酶似乎不参与这一过程[34]。 病毒自身编码的蛋白酶对其自身复制所必需的酶的加工成熟起重要作用。 冠状病毒复制所必需的酶有RNA聚合酶(polymerase)和解旋酶（helicase）, 由基因组5′端的占2/3～3/4的两个大的ORF（ORF 1a和1b）（即基因1）所编码。 藉核糖体阅读框移行(ribosomal frameshift)机制, 基因1可被翻译产生ORF 1a和ORF 1ab两个多肽前体（pp1a和pp1ab）(图2)。
Fig.2 The genome RNA structure of coronavirus[34]
L, leader sequence； AP, accessory proteinase； hd, hydrophobic domain； MP, main
proteinase； RdRp, RNA-dependent RNA polymerase； Z, p utative zinc finger； HEL, NTPase/RNA
helicase； C, conserved domain. The amino-terminal parts of the coronavirus
replicase polyproteins are processed by accessory proteinases, whereas the
remainders of the polyproteins are cleaved by the main proteinase.
迄今已知pp1a多肽前体主要由辅助蛋白酶区（PLP1, 2）, 主要蛋白酶区（3CLpro）, 疏水区（HD）等组成, 而pp1ab前体内有如下结构域： 除了pp1a所编码的蛋白外, 还有RNA聚合酶, 解旋酶和锌指区等[34]。 PLP1, 2蛋白酶主要参与RNA聚合酶上游蛋白质的加工, 而RNA聚合酶和解旋酶等由3CLpro蛋白酶加工成熟(图2, 3)。 PLP酶切所产生的蛋白对病毒是必需的, 能激活病毒mRNA的合成[35]。 3CLpro是冠状病毒主要的蛋白质加工酶, 对病毒的复制增殖至关重要, 这已为许多3CLpro突变体及其抑制剂等实验所证实[36,37]。 SARS病毒的基因组分析表明[5,15], 其复制酶(replicase)ORF1a和1b占整个基因组的2/3, 长度和所编码的氨基酸序列与其他冠状病毒具有很高同源性(图4)。 3CLpro对SARS病毒的复制增殖至关重要, 这将为SARS的防治提供一个很好的药物靶点。
Fig.3 Overview of the proteolytic processing of human coronavirus replicases[33]
Fig.4 The genome RNA of SARS virus[5,15]
265－21 486 bp occupying 2/3 of the whole genome encodes the non-structure
proteins ( replicases 1A and 1B including PLP2, 3CLpro, RdRp, HEL ), while the
remainders encode the structure proteins （S, E, M, N）.
冠状病毒的结构性膜蛋白均为糖蛋白, 糖链可以O-或N-方式连接到膜蛋白上。 对于M蛋白, 第二类冠状病毒的糖链是以O-方式连接, 而第一、 三类冠状病毒则采用N-连接方式。 虽然MHV的M蛋白O-糖基化对病毒样颗粒的组装和病毒的生长均没有影响, 但用N-糖基化取代后病毒样颗粒的组装效率明显下降[12,38]。 考虑到冠状病毒M蛋白上糖基化序列具有高度保守性, 其糖基化修饰可能与病毒-宿主间相互作用有关。 MHV-2是MHV家族具有高度侵染力的病毒株, 与MHV-A59的区别在于其M蛋白不仅被O-糖基化, 还被N-糖基化[39]。 对MHV-A59的S蛋白进行N-糖基化修饰能影响S蛋白的成熟和胞内运输及病毒颗粒的组装和释放[40]。
2.3 病毒颗粒的组装和释放
冠状病毒是一种有包膜的RNA病毒, 其蛋白均在宿主细胞内翻译和加工。 S和M蛋白是所有冠状病毒的主要结构蛋白, 在病毒体上还有少许的小分子E膜蛋白, 另外有些冠状病毒还有HE蛋白等, 它们的相互作用是组装成病毒颗粒的基础[14]。 冠状病毒颗粒的组装发生在内质网和高尔基体间的区域(intermediate compartment)[28]。 N蛋白首先在胞浆中与病毒基因组RNA结合, 形成螺旋形的核衣壳（nucleocaspsid）。 核衣壳的N蛋白可进一步与病毒的E, S, M蛋白相互作用, 进而组装成病毒颗粒。 但病毒样颗粒的组装却不依赖于核衣壳, 单纯的M和E蛋白就足以形成病毒样颗粒[38]。 由于E蛋白在病毒体上表达很少, M蛋白对病毒颗粒的组装显得更加重要。 如前所述, M蛋白可分为： 一个大的C端病毒体内区, 三个穿膜片段和一个短的N端病毒体外区。 病毒外壳组装的驱动力主要来自于M蛋白穿膜区的侧向相互作用, 而且这种作用对同源M蛋白具有很高的选择性[41]。 S蛋白通过其C端的跨膜区和病毒体内区与M蛋白以非共价键连接而整合入病毒颗粒。 E蛋白对病毒的复制增殖虽不是必需的, 但缺乏了E蛋白, 病毒组装明显受到影响且生长缓慢[42]。 冠状病毒基因组RNA核心的组装首先是通过N蛋白结合基因组RNA上的特殊包装序列并形成核衣壳, 进一步在病毒的出芽附近(即高尔基体前区)藉N蛋白与M蛋白的相互作用选择性组装基因组RNA。 冠状病毒在宿主细胞内能产生基因组RNA和6～8种亚基因组mRNA, 虽然N蛋白可与病毒的所有mRNA结合, 但只有结合基因组RNA的N蛋白才能与M蛋白发生相互作用, 且这一过程不需要S、 E蛋白的参与。
进一步实验表明, 这种对病毒基因组RNA的高度选择性包装, 是由病毒基因组RNA上的特殊包装序列信号(package signal)所调控的[43]。 对MHV而言, 这种包装序列（约61bp）位于离5′端21 kb附近[44]。 最近Narayanan等[45]还进一步证实,