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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN 0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(6): 536-541
CN 31-1300/Q |
Identification of Bone Marrow Stromal Cells and Expression of Tyrosine Hydroxylase Gene in Them
LU Ling-Ling, SU Yu-Jin, ZHAO Chun-Li, ZOU Xi-Feng, HOU Shao-Ping, XU Qun-Yuan, YANG Hui*
( Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100054, China )
Abstract The study is to establish the method of isolation and identification of bone marrow stromal cells and to investigate the ability of bone marrow stromal cells to accept and express TH gene. Cells were isolated by a density gradient (lymphocytes separation) and identified by BrdU labeling and fluorescence-activated cell sorting (FACS) technology using CD11b, CD45 and CD90 antibodies. TH and lacZ gene were transfected to rBMSCs with an adeno-associated virus vector. The results showed that most tightly adherent cells in the primary culture were fibroblast-like and formed foci of two to four cells. The cells in the foci remained dormant for 2 to 4 days and then began to multiply rapidly. After several passages, the adherent cells became more uniformly spindle-shaped in appearance. BrdU, indicating that BMSCs replicate actively, labeled about 74.9% of cultured cells. Data from FACS showed that about 75% of isolated cells were CD90+/CD45－/CD11b－, which is the marker of bone marrow stromal cells. The efficiency of TH gene transfection was about 75%. BMSCs could readily be genetically engineered and could be useful delivery targets of gene therapy for Parkinson’s disease.
Key words bone marrow stromal cells; Parkinson's disease; adeno-associated virus vector; TH gene
Received: January 20, 2003 Accepted: March 10, 2003
This work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China （No. 30240055）, and the Key Program (B) of Beijing Natural Science Foundation
*Correspondence: Tel, 86-10-63051480; Fax, 86-10-63056992; e-mail, [email protected]
骨髓基质细胞的分离、鉴定以及TH基因的转染与表达
鲁玲玲 苏玉金 赵春礼 邹西峰 侯少平 徐群渊 杨慧*
( 首都医科大学北京神经科学研究所、北京市神经再生修复研究重点实验室, 北京 100054 )
摘要 目的是探索骨髓基质细胞的分离培养、鉴定及其接受并表达TH基因的能力。 实验中通过密度梯度离心法成功地从成年SD大鼠骨髓中分离获得了骨髓基质干细胞， 并用流式细胞仪对其进行鉴定， 纯度可达75%。 进一步采用复制缺陷型腺相关病毒载体介导的基因转染方法， 将之改造成为携带lacZ与TH基因的工程细胞， 经X-gal染色和TH免疫组化检测， 转染效率为(74.6±19.4)%。 实验结果表明骨髓基质细胞易于接受并表达外源基因， 有望作为运载细胞应用于帕金森病的基因治疗。
关键词 骨髓基质细胞; 帕金森病; 腺相关病毒载体; TH基因
骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）是造血微环境的重要组成成分, 可以分泌多种与造血有关的正负调控因子， 发挥调控造血的作用。 近年来发现骨髓基质细胞具有干细胞的特征， 而且具有多向分化的潜能， 属于多能干细胞[1,2]。 在体外特定培养条件下， BMSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及成肌细胞等间充质细胞, 因此人们曾将之称为间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）[3～7]； 近来甚至发现BMSCs还可以分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞与神经元[3,8～10]。 因此， 简单地称之为间充质干细胞已不确切， 而应称其为多潜能成体干细胞（multipotent adult progenitor cells, MAPCs）[11,12]。 由于具有多向分化潜能， 骨髓基质细胞是细胞与基因治疗潜在的理想工具， 在一些疑难疾病如成骨缺陷、肌肉损伤和中枢神经系统变性等的治疗中有着广阔的应用前景[4,7,13～15]。 既然骨髓基质细胞具有如此巨大的应用潜力, 那么如何获得确实可靠的BMSCs并使之高效地携带目的基因， 便是我们当前面临的主要问题之一。
本文通过分离、体外培养与鉴定， 获得了纯度较高的BMSCs， 并对其进行基因改造， 使之携带并表达酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）基因。
1 材料和方法(Materials and
Methods)
1.1 试剂与实验动物
α-MEM（Gibco BRL）; 淋巴细胞分离液（TBD生物发展中心）; CD11b-FITC、 CD45-CY、 CD90-PE （BD Pharmingen）; 5-溴-2′脱氧尿嘧啶(BrdU)标记及检测试剂盒I (Roche); 胰酶和EDTA （Sigma）; HindIII和BglII(TaKaRa); T4 DNA连接酶、 质粒提取与纯化试剂盒（Promega）; 小鼠抗人的TH单克隆抗体、生物素化山羊抗鼠IgM、辣根酶标记链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、 DAB显色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）; β-gal染色试剂盒（Stratagene）； pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-lacZ（Stratagene）; pSP72-hTH (本所构建)； 人胚肾细胞HEK293（ATCC, Catalog #CRL-1573）； 人纤维肉瘤细胞HT1080（ATCC, Catalog #CCL-121）； 成年雄性Sprague-Dawley大鼠， 体重180～220 g， SPF级（首都医科大学动物科学部提供）； 流式细胞仪用 FACS Calibur (BD公司)。
1.2 骨髓基质细胞的分离与培养
将成年雄性SD大鼠断头处死， 常规消毒四肢及胸部皮肤后， 迅速取出四肢骨及胸骨， 以预冷的PBS（含105 u/L青霉素、0.1 g/L链霉素）冲洗两遍后， 用7号注射针头吸取无血清的α-MEM冲洗骨髓腔以获取骨髓细胞的冲洗液。 取细胞冲洗液1份， 小心加于2倍体积的淋巴细胞分离液之上， 以2500～3000 r/min离心， 室温， 25～30 min。 用吸管吸取液面交界处云雾状液体， 放入含PBS 4～5 mL的离心管中， 充分混匀， 以800 r/min离心， 室温， 5 min。 弃上清液， 管内沉淀用PBS冲洗一遍后， 以含有20%胎牛血清的α-MEM重新悬浮细胞， 接种至50 mL塑料培养瓶， 置CO2培养箱中培养。 培养条件： 37 ℃， 5% CO2。 培养24 h后细胞贴壁, 之后换液。
1.3 细胞HE染色
待细胞长至70%～80%汇合时， 弃去培养基。 以4%多聚甲醛固定后常规HE染色。
1.4 流式细胞仪检测骨髓基质细胞的纯度
以含0.25%胰酶/0.02%EDTA的PBS消化细胞3～5 min， 加入培养基终止胰酶作用， 用弯头吸管吹打使成单细胞悬液， 800～1000 r/min离心， 室温， 5 min。 弃上清液， 细胞沉淀用PBS冲洗一遍后， 制成单细胞PBS悬液300 μL。 将细胞悬液平均分到5只Eppendorf管中, 取四管依次加入 CD11b-FITC、CD45-CY、CD90-PE、CD11b/CD45/CD90, 剩余一管不加任何抗体， 做空白对照。 4 ℃, 避光， 培育30 min。 PBS冲洗1遍后放入冰盒， 避光， 进行流式细胞仪检测。
1.5 BrdU标记及检测
应用5-溴-2′脱氧尿嘧啶(BrdU)标记及检测试剂盒I。 参照试剂盒使用说明， 待细胞大约长至50%汇合时， 吸弃培养基， 加入BrdU标记培养基， 37 ℃, 5% CO2培养箱中培育15～60 min。 弃去培养基， PBS冲洗后， 以70%乙醇固定。 一抗为小鼠的抗BrdU抗体， 二抗为带FITC的抗小鼠的荧光抗体， 进行免疫反应。 缓冲液（试剂盒中自带）冲洗3遍后透明封片， 于荧光倒置显微镜下观察。 激发光波长为450～500 nm， 发射光波长为515～565 nm(绿色)。 随机选取5个视野， 分别计数暗视野下绿色荧光细胞数（即阳性细胞数）和明视野下细胞总数。 BrdU标记阳性率=阳性细胞数/细胞总数。 最后计算5个阳性率的算术平均值即是实验最终的BrdU标记阳性率。
1.6 pAAV-TH的构建与质粒纯化
用HindIII和BglII分别酶切pAAV-MCS和pSP72-hTH质粒， 得到pAAV-MCS和hTH的线性片段。 在T4 DNA连接酶的作用下， 4 ℃, 连接16 h。 酶切鉴定正确， 获得pAAV-TH。 以纯化试剂盒提取转染所需各种质粒， 包括pAAV-hTH、pAAV-lacZ、pAAV-RC和pHelper。
1.7 AAV介导的基因转染
包装病毒前， 将HEK293细胞按3×106个/100 mm2 的密度接种于培养皿中， 在10 mL DMEM生长培养基（含10%胎牛血清）中培养48 h。 从－20 ℃冰箱中取出各种转染用的质粒： 重组pAAV-TH、pAAV-Helper、pAAV-RC和对照pAAV-lacZ。 吸取三种质粒（重组pAAV-TH、pAAV-Helper和pAAV-RC）各10 μg到转染管中， 阳性对照组取三种质粒pAAV-lacZ、pAAV-Helper和pAAV-RC各10 μg到另一个转染管中， 分别加入1 mL 0.3 mol/L CaCl2轻轻混匀。 再准备另外两个转染管， 分别加入1 mL 2×HBS， 将上述1.03 mL DNA/CaCl2混合液逐滴加入HBS中， 轻轻混匀。 静置约10 min后， 将DNA/CaCl2／HBS混合液滴加到培养皿中， 轻轻混匀使混合物在培养基中均匀分布。 将培养皿送回37 ℃培养箱中培育6 h。 然后， 换正常培养基10 mL继续培养66～72 h。 待培养基颜色变黄， 细胞变圆漂浮之后， 收集病毒上清液。 利用HT1080细胞检测病毒滴度为107个/mL。 然后用病毒上清液直接感染骨髓基质细胞。
1.8 TH免疫细胞化学染色与β-gal染色
TH基因表达通过免疫细胞化学染色检测。 4%多聚甲醛固定细胞。 以10%山羊血清封闭非特异性抗原后， 依次加入小鼠抗人的TH单克隆抗体（1∶2000稀释）， 4 ℃温育12 h； 生物素化山羊抗鼠IgM（1∶200稀释）室温温育2 h； 辣根酶标记链霉抗生物素蛋白（1∶200稀释）室温温育2 h。 最后以DAB（3， 3′-二氨基联苯胺四盐酸盐）显色。 透明封片后， 在倒置显微镜下计数阳性细胞并计算转染效率， 具体方法同1.4节。
lacZ基因表达的检测使用β-gal染色试剂盒。 具体操作参见产品使用说明。
2 结果(Results)
2.1 骨髓基质细胞的形态学特征
分离培养的原代骨髓基质细胞呈克隆性生长， 培养的前2～4天细胞处于休眠状态， 之后快速增殖， 细胞排列紧密， 呈漩涡状[图1（A）]。 细胞形态多样, 类似成纤维细胞, 呈异质性， 以长的梭形细胞为主， 也有三角形、多角形和星形细胞， 伸出长短不一、粗细不均的胞质突起。 传代后， 细胞形态趋于同一。 HE染色结果发现胞核大， 核仁1～5个[图1（B）]。
Fig.1 Normal undifferentiated rBMSCs
(A) BMSCs in culture at 10 days after plating. Most cells are spindle-shaped in appearance, ×200. (B) HE staining of cultured rBMSCs at 20 days. The cytoplasm was stained pink and the nucleus was blue, ×400.
2.2 流式细胞仪检测
将培养的骨髓基质细胞利用流式细胞仪检测细胞表面标记物。 结果发现CD90阳性细胞达到95.17%； CD45阳性细胞数仅7.76%； CD11b阳性细胞数仅7.37%（图2）； 将三种细胞表面标记物组合发现， CD90+/CD45－/CD11b－细胞数约为75%（图3）。
Fig.2 Characterization of rBMSCs by cell surface marker seperately
(A) Fluorescence intensity is greater (shifted to the right) when
rBMSCs were incubated with PE-conjugated CD90 antibody compared with control.
95.17% of cells in the culture express CD90. (B) The rBMSCs incubated with
CD45-CY antibody. Only 7.76% cells were positive compared with control. (C) The
rBMSCs incubated with CD11b-FITC antibody. Only 7.37% cells were positive
compared with control.
Fig.3 Characterization of rBMSCs by combined cell surface markers
Cells were incubated with CD90-PE, CD45-CY and CD11b-FITC. Intensity of
CD90-PE (A) and CD45-CY (B) is plotted on the y-axis and intensity of
CD11b-FITC is plotted on the x-axis. (A) The vast number(85.89%) of cells were
positive for CD90 antibody and negative for CD11b. (B) The cells in the upper
left quadrant of (A) were taken for analysis of CD45 antibody. The 86.89% of
cells were negative for CD45-CY, indicating that about 75% (85.89%×86.89%) of
isolated cells were CD90+/CD45－/CD11b－.
2.3 BrdU体外标记
多数大鼠BMSCs的细胞核被BrdU所标记， 呈阳性， 具体数据见表1。 经计算阳性率为(74.9±7.6)% （图4）。
Table 1 The efficiency of BrdU labeling
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No. of BrdU labeled nuclei |
No. of all cells |
Efficiency（%） |
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1 |
27 |
33 |
82.0 |
|
2 |
18 |
25 |
72.0 |
|
3 |
29 |
42 |
69.0 |
|
4 |
21 |
31 |
67.7 |
|
5 |
32 |
38 |
84.2 |
+s=(74.9±7.6)% (n=5)
Fig.4 Identification of rat bone marrow stromal cells by BrdU labeling and detection
Marrow stromal cells were stained with a mouse anti-BrdU antibody, detected with an FITC-conjugated anti-mouse secondary. (A) Most nuclei of cells were stained green by FITC, ×200. (B) B is the same location of A under a light microscopy, ×200.
2.4 AAV介导的基因转染
绝大多数骨髓基质细胞呈LacZ[图5（A）]、TH阳性[图5（B）]， 计算TH阳性细胞， TH基因转染效率为(74.6±19.4)%(表2)。
Fig.5 The expression of LacZ and TH genes in transduced rBMSCs
(A) X-gal staining cells for
Lac-Z, ×100. (B) Immunocytochemical staining cells for TH, ×100.
Table 2 Transfection efficiency of TH gene
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No.of TH+ cells |
No. of all cells |
Transfection efficiency（%） |
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1 |
12 |
14 |
85.7 |
|
2 |
9 |
9 |
100.0 |
|
3 |
7 |
14 |
50.0 |
|
4 |
8 |
12 |
75.0 |
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5 |
5 |
8 |
62.5 |
3 讨论(Discussion)
BMSCs从发现至今已有100多年的历史。 Conheim最初发现的时候， 认为与损伤修复有关[5]。 后来Friedenstein等[16]于1974年首次从骨髓中分离得到了骨髓基质细胞。 随着对骨髓基质细胞研究的不断深入， BMSCs的培养方法也在不断改进， 从最初Friedenstein的直接贴壁法， 到常用的密度梯度离心法， 最近又发展出现了磁珠分选法。 方法越来越先进， 获得的BMSCs也越来越纯， 达到90%多。 但是， 最原始的贴壁法仍有其自身的优点： 经济实用、操作简便。 而相比之下， 磁珠分选法虽然获得的细胞纯， 但费用昂贵， 操作复杂。 密度梯度离心法介于二者之间。 究竟哪一种方法更合适， 要取决于个人的不同需求。 本实验通过密度梯度离心培养BMSCs， 经流式细胞仪及BrdU体外标记证实其纯度大于70%。 本实验最终目的在于利用分离纯化的BMSCs携带TH基因治疗帕金森病, 70%的纯度应该可以达到这一目的， 因此我们没有进一步对其分选纯化。 如果有条件， 先通过流式细胞仪分选得到较纯的骨髓基质细胞， 然后再导入外源基因， 用于治疗， 效果可能会更好。 但是， 如果从临床应用的角度考虑， 分选虽然能使细胞纯化， 同时也延误了治疗时间， 而且会增加污染的机会。
骨髓基质细胞的鉴定一直缺乏一种确切有效的方法[17～20]。 本实验通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD11b、CD45(二者属造血系细胞标记物)、CD90（表明细胞处于原始的未分化状态）[3], 排除骨髓来源的造血干细胞， 标记为CD11b－/CD45－/CD90+的细胞就是实验需要的骨髓基质干细胞。 这种方法不仅可以作为大鼠骨髓基质干细胞的一种鉴定方法， 也可以借助流式细胞仪分选进一步纯化细胞。 另外， 我们通过BrdU体外标记骨髓基质细胞， 测得阳性率为74.9%。 BrdU是5-溴-2′-脱氧尿嘧啶， 在DNA合成过程中可以替代脱氧尿嘧啶参入到细胞的染色质中。 因此， 只有处于增殖态S期（即DNA合成期）的细胞才能被BrdU标记显阳性。 我们分离培养获得的骨髓基质细胞74.9%呈BrdU标记阳性， 说明大多数细胞处于增殖态， 从而间接说明其具有干细胞自我增殖的特性。
我们分离培养的原代骨髓基质细胞呈克隆性生长， 形态类似成纤维细胞。 这与Friedenstein等[16]的研究结果相吻合。 细胞形态多样， 呈异质性， 以长的梭形细胞为主， 也有三角形、多角形和星形细胞， 伸出长短不一、粗细不均的胞浆突起， 这种现象有人称之为集落形成单位(colony-forming unit， CFU)。 而其在体外培养中之所以呈现异质性可能与其诱导分化过程中的信号转导路径有关。 有文章报道[21]， 认为骨髓基质细胞可以有多种分化途径， 而且， 在分化过程中， 有几个不同的阶段。 每一个阶段， 骨髓基质细胞的分化都有可能被打断而终止在某一点。 比如， 有的细胞可能终止在分化早期， 有的细胞可能处于分化中期， 而有的则到达分化晚期， 成为分化成熟细胞。 这就导致了培养细胞在形态上呈现异质性。 由于我们在培养过程中未加任何的抑制细胞分化的细胞因子, 因此细胞难免会发生分化。 但BrdU标记表明多数细胞处于增殖状态。 HE染色也显示， 大多数细胞核浆比例大， 表明我们培养的细胞多数处于相对幼稚的干细胞状态。 而且， 我们培养的BMSCs是被用作一种基因治疗的运载工具， 不仅仅是依靠其在原位诱导分化成特定的神经元来达到治疗作用； 只要它能够携带治疗基因进入靶器官， 就能发挥作用。 因此， 部分细胞分化为成熟细胞对于我们的实验结果无太大影响。
帕金森病（Parkinsons disease, PD）主要的病理改变在于中脑黑质多巴胺能神经元的变性缺失， 使通过黑质-纹状体通路运送到纹状体的多巴胺（dopamine, DA）显著减少。 TH是脑内多巴胺合成途径中一个重要的限速酶。 我们在AAV病毒载体的介导下把TH转入骨髓基质细胞后， 可以把携带TH基因的BMSCs移植到PD大鼠模型的脑内： 一方面， BMSCs可以表达TH， 促进多巴胺的合成， 从而达到治疗的目的； 另一方面， BMSCs在脑内特定微环境作用下， 有可能定向诱导分化为多巴胺能神经元而发挥作用[22]。
细胞与基因治疗中常存在着两个十分关键的问题。 其一： 运载细胞与宿主之间存在免疫排斥反应； 其二： 基因转染效率低。 而骨髓基质干细胞恰恰可以克服这两个缺点： 可以自体取材， 体外扩增、基因工程改造后可以自体回输， 不存在免疫排斥。 这对其将来应用于临床具有重要意义。 同时， 利用AAV介导的基因转染效率很高， 可达74.6%。