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ISSN 0582-9879                             ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(6): 542-547                             CN 31-1300/Q

Redox-dependent Changes in Structure and Function of hHSF1

LIN Zheng*, HUANG Fan, MA Zhong-Fu, XU Kang, LIU Alice Y1

( The First Hospital Affiliated to Sun Yat-Sen University, Guangzhou, 510080 China; 1Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers State University of New Jersey 08854, USA )

 

Abstract        To evaluate the effects of cysteine-SH-directed regents on the redox status, structure and function of human heat shock transcription factor 1 (hHSF1), treatment in vitro of hHSF1 with 0.3－0.5 mmol/L oxidizing reagent diamide (DM) and treatment in vivo of HeLa cells with 1 mmol/L buthionine sulfoximine (BSO), an inhibitor of γ-glutamylcysteine synthetase, promoted the formation of a compact, intramolecularly disulfide-crosslinked, stable monomeric form of ox-hHSF1, and blocked the trimerization and activation of HSF1. The effects of diamine were dose-dependent and readily could be completely reversed by adding 0.4－0.5 mmol/L reducing reagent dithiothreitol (DTT) to the samples prior to gel electrophoresis. Computer modeling of the α-helical coiled-coil domains of the HSF1 monomer and trimer showed that the alignment of the N- and C-terminal hydrophobic repeats of HSF1 monomer could bring C3（Cys153）close to C4 and C5（Cys373 and Cys378， respectively）， in positions permissible for disulfide bond formation under appropriate experimental conditions. The results suggest that redox-dependent thiol-disulfide exchange can provide a mechanism for regulation the conformation and activity of hHSF1.

 

Key words     hHSF1; redox; thiol; cysteine

 

Received: January 20, 2003   Accepted: March 20, 2003

This work was supported by the grants from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30070829) and Guangdong Natural Sciences Foundation (No. 001324)

*Corresponding author: Tel, 86-20-87331142; e-mail, [email protected]

 

氧化还原作用对热休克转录因子1结构和功能的调控

林正* 黄帆 马中富 徐康 LIU Alice Y1

( 中山大学附属第一医院中心实验室， 广州 510080； 1Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers State University of New Jersey 08854 )

 

摘要       为了评价半胱氨酸巯基氧化还原介导剂对人热休克转录因子1(hHSF1)的氧化还原、 结构和功能的作用， 在体外用浓度为0.3～0.5 mmol/L的巯基氧化型介导剂二酰胺（diamide DM）处理hHSF1; 在体内用浓度为0.1 mmol/L的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫堇处理HeLa细胞, 都可形成一种致密的、 分子内二硫键交联的氧化型hHSF1（ox-hHSF1）， 使hHSF1三体形成和活化被阻断。 二酰胺的这种作用呈剂量依赖； 在电泳前加入浓度为0.4～0.5 mmol/L的巯基还原剂二硫苏糖醇（DTT）到DM处理过的标本中再培育, 能迅速和完全逆转这种作用。 HSF1单体和三体功能域α-螺旋卷曲结构的计算机模型显示， 在hHSF1单体N端和C端的疏水重复区中， 半胱氨酸C1（第153位氨基酸）与半胱氨酸C4（第373位氨基酸）、C5（第378位氨基酸）非常接近， 在合适的氧化作用下很容易形成二硫键, 使HSF1单体形式较为稳定， 不能形成三体并活化。 结果表明， hHSF1的结构和功能与半胱氨酸上巯基的氧化还原化学性能相关;氧化作用和转录因子分子内巯基二硫键交联形成ox-HSF1单体， 可能是衰老细胞热体克转录反应呈渐减性的原因。

 

关键词   人热休克转录因子1; 氧化还原; 巯基； 半胱氨酸

 

很多证据已表明， 衰老以及大部分与年龄相关的疾病都与蛋白质的氧化损伤有关， 并伴有被氧化修饰的蛋白质水平的升高[1～4]。 细胞中对氧化还原作用特别敏感的主要成分是转录因子， 如核因子Kappa B (NF-κB) 、活化蛋白1（AP-1）、缺氧诱发因子1（HIF-1）、热体克转录因子1（HSF1）等[5～7]。 HSF1属于核转录因子， 主要调节细胞对热和其他形式应激的反应。 高等真核细胞处于非应激状态时， HSF1以无活性的单体形式存在于细胞质中； 应激状态时， HSF1单体产生核转移并去折叠形成同源三体， 进一步被激活并与DNA（热激元件， HSE）相结合， 从而启动了一系列基因的表达。 作者和其他实验室早期工作提示， HSF1启动的转录反应在细胞和生物体衰老过程中呈渐减性[8,9]。

巯基作为蛋白质氨基酸中具特殊功能的基团， 是维持细胞氧化还原平衡的关键成分， 在细胞氧化还原反应中起敏感的“开关器”作用[10]。 巯基二硫键转换具有氧化还原依赖性， 也是翻译后的修饰机制之一， 主要调节蛋白质的结构与功能[11]。 最近报告指出， 能发生可逆性氧化还原反应的核转录因子中的半胱氨酸巯基是维持细胞氧化还原平衡的关键成分[12]。 氧化还原作用可能影响hHFS1的半胱氨酸巯基的基本结构， 从而导致其三体形成和活化功能发生改变。

本实验使用巯基氧化还原介导剂在体外和体内作用于hHSF1， 试图去了解这些氧化还原介导剂对hHSF1结构和功能的作用。 并利用HSF1单体和三体功能域α螺旋卷曲结构的计算机模型证实以上实验结果， 最后讨论了细胞衰老中热休克转录反应呈渐减性的可能原因。

 

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   材料

多克隆抗hHSF1抗体由Dr.Liu的实验室使用组氨酸标记的hHSF1 免疫成年新西兰白兔产生， 经Qiagen公司的Ni2+-次氮基三乙酸树脂纯化(Ni2+-nitrilotriacetic acid resin)； ECL Western 印迹检测药盒、 [α-32P]dATP (S.A. 3000 Ci/mmol) 购自Amersam公司； 二酰胺和二硫苏糖醇购自Sigma公司； 在凝胶电泳迁移率变动分析（EMSA）试验中检测hHSF1-DNA结合活性的合成寡核苷酸HSE序列为5′-GCCTCGAATGTTCGCGAAGTTTCG-3′（正链）。

1.2   方法

1.2.1       细胞培养和S100细胞提取液制备      单层HeLa细胞生长在含10%胎牛血清和适量抗生素的DMEM培养液中, 5% CO2， 37 ℃； 热休克处理细胞的条件是42 ℃， 60 min。

为了获得高浓度的hHSF1以保证hHSF1-DNA结合活性检测效果， 按文献[8]的方法制备HeLa细胞S100提取液。 用4倍体积缓冲液A[15 mmol/L HEPES(pH 7.9)、10 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、 0.5 mmol/L DTT、 0.5 mmol/L PMSF、1 mg/L亮抑酶肽（leupeptin）和抑胃酶肽（pepstatin）、10 u/L 抑蛋白酶肽（aprotinin）]悬浮离心后收获的细胞， 再离心， 用2倍体积同一缓冲液再悬浮， 置冰浴中15 min， 然后用杜氏匀浆器磨碎细胞。 10 000 g离心细胞匀浆, 8 min， 沉淀的细胞核留作制备核提取液。 转移上清液到新的1.5 mL离心管， 加入1.1倍的缓冲液B[180 mmol/L HEPES(pH 7.9)、20%甘油、1.0 mol/L NaCl、13.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L DTT、0.5 mmol/L PMSF、1 mg/L亮抑酶肽和抑胃酶肽、10 u/L抑蛋白酶肽]， 充分混合后， 再超速离心100 000 g， 60 min。 最后在50倍的缓冲液D[25 mmol/L HEPES (pH 7.9)、 22%甘油、100 mmol/L KCl、0.2 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L PMSF、0.5 mmol/L DTT]内， 4 ℃透析上清液4 h。 分装， 保存在－70 ℃中备用。

1.2.2       细胞内谷胱甘肽缺乏对hHSF1的调节影晌      为了研究具抗氧化作用的谷胱甘肽缺乏对细胞内氧化还原状态和hHSF1结构及功能的影响， 加1 mmol/L γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫堇（buthionine sulfoximine， BSO）到培养的HeLa细胞中。 37 ℃培育24 h， 接着再培育2 h作对照或热休克处理。 然后收集细胞并根据描述的方法制备全细胞提取液[6]。

1.2.3       Western印迹          使用非变性凝胶蛋白质电泳、 凝胶和电泳缓冲液中， 均不含SDS以免蛋白质变性。 为了能在电泳中检测hHSF1的氧化还原构象， 标本缓冲液中不含巯基还原剂， 如β巯基乙醇(β-mercaptoethanol)和DTT。 电泳前把0～0.5 mmol/L的DM或DTT加到含hHSF1的S100细胞提取液中， 20 ℃培育20 min。 标本经处理和电泳后， 把凝胶放进含5 mmol/L DTT的平衡缓冲液中置15 min， 然后再在含1 mmol/L DTT的转移缓冲液中通过SD-Dry半干转移槽把蛋白质转移到硝酸纤维素薄膜上。 第一抗体为抗hHSF1多克隆抗体（1∶2500）， 第二抗体为棘根过氧化酶连接的羊抗兔IgG。 使用ECL Western药盒检测结果。 特异性hHSF1的分子量约为85～90 kD。

1.2.4       凝胶电泳迁移率改变试验（EMSA）检测hHSF1-DNA结合活性          如文献[6]所述， 用0～1 mmol/L DM在20 ℃中处理含20 μg蛋白质的S100细胞提取液10 min， 然后在42 ℃中热处理标本60 min。 为了检测DTT对DM的逆转作用， 在热处理前加入5 mmol/L DTT到特定标本中室温下培育10 min， 然后把这些已处理过的标本与含25 000～30 000 cpm的32P标记的含有4个反向重复的NGAAN HSE序列作用， 同时加入500 ng Poly(dI/dC)用以结合非特异性蛋白质。 25 ℃培育30 min。 最后在4%低离子、非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。

1.2.5       hHSF1单体和三体α-螺旋卷曲功能域的计算机模型分析      采用Tripos Associates公司(ST.Louis, MO, USA)的Syby1软件分析系统， 通过国际互联网Blast系统的氨基酸序列搜索。 HSF1单体螺旋卷曲结构以序列相似的MHC相关FC受体结构为基础； HSF1同源三体功能域螺旋卷曲结构， 以流行性感冒病毒红细胞凝集素三体螺旋型卷曲部位为基础。

 

2    结果(Results)

为了探讨氧化还原介导剂怎样改变hHSF1构象而影响其激活功能， 本试验使用促进蛋白质巯基二硫键交联的氧化介导剂DM与含有hHSF1的S100细胞提取液共同培育20 min。 早期使用常规Western印迹法， 发现加入DM后的标本失去免疫检测活性， 但使用巯基还原介导剂DTT可使hHSF构象重新出现， 估计可能是二硫键的形成屏蔽了hHSF1抗原核心, 以致抗hHSF1抗体失去识别能力。 为此， 考虑在电泳后用DTT处理已分离蛋白质的凝胶， 使二硫键断裂， 恢复其免疫识别能力而有可能检测出DM所致的ox-hHSF1构象。 通过此方法， 无论在变性凝胶或非变性凝胶电泳中都可发现一个明显的ox-hHSF1。

2.1   hHSF1的氧化还原构象

图1显示， 在非变性凝胶电泳的Western印迹中使用抗hHSF1抗体， 无论在全细胞或S100提取液， 如果没有巯基氧化剂DM的作用， 只出现hHSF1信号[图1（A）， 泳道1、2]。 但浓度为0.3 mmol/L以上的DM与蛋白质标本在25 ℃中培育10 min， 即可出现一个电泳移动明显快速的蛋白质带[图1（A）， 泳道 5～7]并随DM剂量加大而增加； 而在电泳前加入浓度为0.4 mmol/L以上的巯基还原剂DTT到DM处理过的标本中再培育(25 ℃, 10 min)， 能使这种蛋白质迅速逆转[图1（B）， 泳道6、7]。 另外， 我们还曾从非变性凝胶电泳中把这种移动快速的蛋白质洗脱出来， 用10 mmol/L DTT还原后， 再电泳， 发现其变为一种85～90 kD的正常hHSF1蛋白质（图未显示）。 这有力说明电泳中移动快速的蛋白质带并非hHSF1降解产物， 而是一种分子内二硫键交联的ox-hHSF1。

 

Fig.1       Detection of redox conformers of hHSF1 in dose-response effect of DM and DTT

(A) Effects of DM: dose response. (B) Reversal of the effects of DM by DTT: dose response. All Samples were subjected to electrophoresis in a 5.5% native-PAGE and Western blot probing for hHSF1. The position of the oxidized conformer of hHSF1 is as indicated. WCE, whole cell extract.

 

2.2   在体外DM抑制了hHSF-HSE结合活性

因为三体形成需要hHSF1单体去折叠， 但分子内二硫键交联稳定了蛋白质的结构。 因此， 估计DM所诱导的hHSF1二硫键交联的结果有可能抑制了hHSF1的三体形成和活性。 图2中， 使用凝胶电泳迁移率改变试验评价了DM对hHSF1在体外被热休克激活的影响。 发现用DM处理S-100细胞提取液中的hHSF1时， 其对hHSF1与DNA（热激元件HSE）结合能力的抑制随DM剂量增加而加大， 当浓度为0.5 mmol/L时达到完全抑制效果[图2， 泳道9]， 与图1（A）比较， 这个浓度与导致ox-hHSF出现最明显的浓度一致。 DM对HSF1活性抑制的特异性亦表现为， 当在电泳前将5 mmol/L巯基还原剂DTT加到标本中， 20 ℃培育30 min能迅速逆转DM的作用[图2，泳道11]， 这都说明了巯基氧化剂对hHSF1的构象和活性的特殊作用。

 

Fig.2       DM inhibited the in vitro activation of HSE-binding activity

EMSA of the effects of DM treatment on the in vitro activation of HSE-binding activity. Aliquots of the extract containing 20 μg of protein were treated with 0-1 mmol/L of DM(lanes 4-10) prior to subjecting the sample to in vitro heat activation. A sample served as the nonactivated control (lane 3). To test for reversibility of the effect of DM, DTT (5 mmol/L) was added to a sample (lane 11) and incubated at 25 ℃ for 10 min prior to heat activation. The positions of the hHSF1-HSE complex, nonspecific protein bound HSE and the free HSE probe on the gel are as indicated. WCE, whole cell extract.

 

2.3   细胞内缺乏谷胱甘肽促使ox-hHSF1形成和抑制hHSF1-HSE结合活性

为了进一步评估hHSF1在体内氧化还原构象的生物学作用， 检测了当缺乏巯基抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）时细胞内hHSF1构象是否改变， 图3中通过非变性凝胶电泳分析hHSF1的氧化还原构象发现， 用γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫堇处理培养中的HeLa细胞， 经热休克后能导致ox-hHSF1的出现[图3（A）, 泳道6]。 在EMSA实验中， 丁硫堇亦抑制了hHSF1-DNA（HSE）的结合活性[图3（B）, 泳道4]。

 

Fig.3       Inhibition of glutathione synthesis in HeLa cell by BSO promoted the formation of ox-hHSF1 and blocked the heat induced activation of HSE binding activity

(A) Redox conformers of hHSF1. Analysis of redox conformers of hHSF1 was by native gel electrophoresis and Western blot probing for hHSF1. 1 and 2, cell extract pretreated without or with DM in vitro for control. 3 and 4, control and heat shocked HaLa cells without BSO pretreatment; 5 and 6, cells pretreated with 1mmol/L BSO. (B) EMSA of HSE binding activity. 1, control, 2, heat shocked; 3, control with BSO; 4, heat shocked with BSO. C, control; HS, heat shock.

 

2.4   hHSF1单体和三体α-螺旋功能区计算机模型

为了鉴定与二硫键形成有关的半胱氨酸， 通过HSF1的氨基酸序列分析， 发现可能形成二硫键的5个半胱氨酸残基位置及相互关系。 注意到半胱氨酸C3（第153位氨基酸）位于氨基端疏水功能区， 而半胱氨酸C4和C5（第373和378位氨基酸）位于羧基端疏水区上游起始点。 有报告认为， hHSF1单体的氨基和羧基端疏水区重叠时最容易形成螺旋卷曲结构[13]， 所以根据上述hHSF半胱氨酸的位置排列， C3和C4、C5有可能靠近在一起形成分子内二硫键交联。 HSF1单体和三体的α-螺旋功能区结构计算机模型分析支持了这一点。 图4中发现， HSF1单体的N端和C端的疏水区重叠， 使得C3和C4、 C5位置非常接近， 这样， 在适当的实验条件下， 很容易形成二硫键。 这种二硫键交联所导致的结果就可能使HSF1形成一种稳定的、结构致密的单体形式， 而不能形成三体并活化。

 

Fig.4       Computer generated models of the coiled-coil domains of the HSF1 monomer and trimer

(A) Ribbon structure of amino acid residues V137-P210 (LZ 1, 2/3; red) and P370-V422 (LZ4; green) of hSF1 as they may appear in an intramolecular coiled-coil domain of the HSF1 monomer. (B) Homotri-meric coiled-coil domain of residues V137-V197 (red, yellow, and blue) as they may appear in the HSF1 trimer.

 

3    讨论 (Discussion)

在决定蛋白质结构、酶活性调节、转录因子激活和结合力调控上， 细胞内半胱氨酸巯基及其氧化还原状态起十分重要的作用[14，15]。 使用巯基介导剂和液相层析质谱仪证实， 通过Ref-1还原关键的半胱氨酸残基（Cys62）对NF-κB激活起重要作用[15]； 同样， 氧化作用使甲状腺转录因子（TTF1）活性功能区半胱氨酸残基（Cys58）结构改变， 形成氧化型TTF1单体， 使其失去与特异DNA结合能力[16]； 氧化还原使转录因子OxyR形成可逆的二硫键， 从而调节其活性[17,18]； RsrA是一种抗Sigma因子， 氧化作用能导致RsrA分子内二硫键形成， 引起它从SigR因子分离而产生σR依赖转录反应[19]; 这都说明半胱氨酸二硫键对蛋白质结构和功能的重要性。 由于蛋白质的半胱氨酸巯基不但和氧及其反应衍生物相关， 而且与含氮残基、一氧化氮相关[10,20,21]， 这有力说明在生物学的调节中转录因子半胱氨酸巯基氧化还原中心起着重要的基础作用。

本研究的结果显示， 无论在体内或体外， hHSF1被氧化剂作用和由此导致的分子内二硫键交联能产生一种稳定的、不能去折叠的ox-hHSF1单体， 从而阻断了hHSF1的三体形成和活化。 结果提示， 对氧化还原作用敏感的蛋白质巯基二硫键改变， 可能调节hHSF1的结构和功能。 图5是根据实验结果形成工作假设总结了以上的可能性。 图中显示： （1）HSF1 529个氨基酸中相应的蛋白质功能区及可能产生二硫键交联的5个半胱氨酸残基位置（DBD， DNA结合功能域； LZ， 亮氨酸拉链区）； （2）正常状态下通过分子间疏水区相互作用的HSF1单体； （3）在氧化剂作用下导致半胱氨酸巯基二硫键交联， 形成对热刺激无活性的ox-HSF1单体； （4）通过分子间疏水相互作用， 稳定被激活的HSF1三体。

 

Fig.5       Schematic illustration of redox dependent changes in the structure and function of hHSF1

In this model, C3(Cys153) and C4， C5(Cys373， Cys378, respectively) were likely to be adjacent, permitting them to be cross-linked in the presence of oxidizing agents. Cross-linking of C3 with C4 or C5 could stabilize the intramolecular coiled-coil structure and prevents its conversion to the intermolecular homotrimeric coiled coil.

 

在这个模型中， 位于LZ1、 2/3中的C3和LZ 4中的C4和C5相邻， 而在HSF1单体中， LZ1， 2/3和LZ4密切相互作用形成二聚螺旋卷曲结构, 所以， 当氧化剂存在时， C3和C4、C5就会形成相互交联。 HSF1的活化由分子内螺旋卷曲结构断裂开始，继而暴露出七价原子重叠疏水区表面， 形式三联的螺旋形卷曲结构导致了hHSF1三体形成并活化。 当C3和C4、C5发生二硫键交联就会稳定了分子内的螺旋卷曲结构， 不能转化为分子间的同源三螺旋卷曲结构。

本研究报告了在HSF1活化过程中， 氧化还原调控基础， 本实验进一步描述了HSF1活化的结构基础， 而这种结构是与氧化还原调节的分子内二硫键交换相关， 重要的是这种巯基的二硫键交换对hHSF1的结构和调节起非常重要的作用， 分子内的二硫键形成可能成为与hHSF1单体的负调节相关的氧化还原调控重要课题； hHSF1分子内二硫键交联亦可能是过去发现的衰老细胞中热休克转录反应呈渐减性的原因。

 

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收稿日期： 2003-01-20      接受日期： 2003-03-20

国家自然科学基金资助项目(No.30070829)和广东省自然科学基金资助项目(No.001324)

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