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ISSN 0582-9879                     ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 717–722 CN 31-1300/Q

Overexpression of STAT3 in COS7 Cells Causes Prominent Morphological Changes

YAN Ye, XIA Cai-Hong, CAO Xin-Min¹, JING Nai-He*

( Laboratory of Molecular Cell Biology and Key Laboratory of Stem Cell Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China; 1Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore 117609, Singapore )

Abstract Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) plays a central role in mediating signals related to cell growth, differentiation, survival and movement. In this report, the results of immunocytochemistry and Western blot analysis showed that the active form of Stat3 protein existed in COS7 cells. The endogenous Stat3 protein could also induce the expression of m67-sequence-directed reporter genes. The transient transfection of Stat3 cDNA into COS7 cells increased Stat3 protein level and the expression of the reporter gene. The overexpression of Stat3 protein in COS7 cells caused prominent cell morphological changes. These cells had a much larger cell body, extended long processes with branches, lamellipodia and filopodia. These results suggest that Stat3 protein may play important roles in cell adhension, migration and cytoskeleton reorganization.

Key words COS7 cell; Stat3; overexpression; cell morphology; reporter gene

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Received: April 29, 2003 Accepted: May 15, 2003

This work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China (No. 39930090, No. 90208011), Major State Basic Research and Development Program of China (973 Program)(No. G1999054000, No. 2002CB713802)

*Corresponding author: Tel, 86-21-54921381; Fax, 86-21-54921011; e-mail, njing@sibs.ac.cn

过量表达Stat3诱导COS7细胞显著的形态变化

颜晔 夏彩虹 曹新民¹ 景乃禾*

( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子细胞生物学重点实验室、 干细胞生物学重点实验室, 上海 200031; 1分子细胞生物学研究所, 新加坡 117609 )

摘要 信号转导和转录激活蛋白Stat3在细胞的生长、 分化、 存活和运动过程中扮演重要角色。 通过免疫细胞化学染色, 免疫沉淀结合免疫蛋白质印迹法, 以及瞬时转染由Stat3特异识别DNA元件所指导的报道基因等技术, 证明COS7细胞中存在活性Stat3蛋白的表达。 Stat3 cDNA和报道基因在COS7细胞中的共转染实验表明, 外源的Stat3蛋白具有DNA结合活性, 并可增强报道基因的表达。 同时, 过量表达Stat3的COS7细胞呈现显著的细胞形态变化, 如细胞体积增大、 胞体伸出突起, 有些突起有分枝和伪足。 这些结果提示, Stat3蛋白在细胞的粘附和迁移, 以及细胞骨架的重建过程中可能具有重要功能。

关键词 COS7细胞; Stat3; 过量表达; 细胞形态; 报道基因

信号转导和转录激活蛋白家族(signal transducer and activator of transcription, Stat)作为潜在的细胞转录因子介导多种生物学反应[1]。 许多细胞因子和生长因子通过与其相关的细胞表面受体结合, 激活酪氨酸蛋白激酶如Src、 Jak, 同时募集Stat转录因子到受体胞质区磷酸化的酪氨酸残基上, 并通过将Stat蛋白上的酪氨酸磷酸化以激活该蛋白质。 活化的Stat形成二聚体, 迅速转位到细胞核内,与其特异的DNA反应元件结合, 启动下游靶基因的转录[2]。 目前, 在哺乳动物中已鉴定出Stat家族的7个成员。 Stat3作为Stat家族的一个重要成员, 于1994年作为急性阶段性反应因子(APRF)被克隆[3,4]。 Stat3可以被许多细胞因子, 如白介素-6(IL-6)、 白血病抑制因子(LIF)、 睫状神经营养因子(CNTF)、 制癌蛋白(oncostatin M)和表皮生长因子(EGF)等激活。 上述细胞因子和生长因子, 通过识别细胞表面糖蛋白gp130与其他分子如LIFR、 CNTFR等形成的受体复合物, 激活Stat3信号转导途径[5]。 在许多体外培养的细胞中, 发现Stat3参与了细胞的生长、 分化和存活过程。 Stat3是gp130介导的细胞存活和G1期至S期转变信号中的关键分子, 而c-Myc和Pim-1被认为是这一过程中Stat3的靶基因[6]。 同时, Stat3对gp130介导的胚胎干细胞多潜能状态的维持[7]、 髓细胞性白血病细胞系M1向巨噬细胞分化, 以及B细胞分化为浆细胞是必需的[8,9]。 此外, 已有的研究结果显示, Stat3在白细胞、 表皮细胞和角质细胞的移动, 以及在斑马鱼早期胚胎的原肠运动中具有功能[10～12]。 以上结果提示, Stat3除了参与细胞生长、 分化和存活过程外, 还可能具有调节细胞运动的功能。 然而, 有关Stat3蛋白引起细胞形态变化的现象还未见报道。 在本文中, 我们发现Stat3蛋白在COS7细胞中的过量表达, 可引起细胞形态发生显著变化。 这一现象提示, Stat3在细胞的粘附和迁移, 以及细胞骨架的重建过程中可能起重要作用。

1 材料和方法(Materials and Methods)

1.1 材料

SV40转化的非洲绿猴肾细胞株COS7为中科院上海生化与细胞所所有。 细胞培养基DMEM/F12、 胎牛血清FBS、 转染用脂质体LipofectAMINE购自Gibco BRL公司; 细胞培养瓶及六孔板购自Corning公司。 RSV-LZRSpBMNZ、 pET23a(+)、 BGZA 等质粒由法国IGBMC Francois Guillemot博士赠送。 Stat3(C-20)多克隆抗体为Santa Cruz产品, phospho-Stat3 (Tyr705)为New England Biolabs产品。

1.2 方法

1.2.1 Stat3表达质粒及报道基因质粒的构建 我们首先将Stat3 cDNA由pRCCMV-Stat3质粒转移至pBluescript II SK(+) 载体中, 并通过测序证实与已报道的小鼠Stat3 序列相同 (GenBank accession No. U06922)。 本文中其他所用质粒的构建如图1所示。 简述如下, Stat3 cDNA约2.9 kb片段以BamHI和HindIII切出, 插入质粒RSV-LZRSpBMNZ的RSV启动子下游, 构建Stat3lacZ表达质粒。 pET23a(+)以EcoRI酶切, Klenow酶补平粘端, 再以NotI切出1.4 kb的IRESGFP片段, 将Stat3lacZ以HindIII酶切, Klenow补平粘端, 再以NotI切除lacZ 片段, 与IRESGFP连接, 构建Stat3GFP表达质粒。 Stat3结合DNA元件m67[13] (ggttcccgtaaatgcatca)的同向四次重复序列4m67退火后末端磷酸化, 插入基本质粒BGZA的β-珠蛋白mini启动子与报道基因lacZ之间的XbaI酶切位点, 得到报道基因质粒4m67lacZ。 从质粒IRESEGFP中以SmaI, XhoI切出1.0 kb的EGFP片段, 将4m67lacZ以NcoI酶切, Klenow补平粘端, 再以XhoI切除lacZ片段, 连入 EGFP, 构建4m67EGFP报道基因质粒。 以上酶切、 连接、 转化及质粒的抽提鉴定, 和转染用质粒DNA的制备方法参考分子克隆手册[14]。

1.2.2 细胞瞬时转染 COS7细胞在含10% FBS的DMEM/F12培养液中贴壁生长, 2～3天传代。 细胞培养于37 ℃, 5% CO2的培养箱中。 细胞转染前接种到poly-L-lysine (10 mg/L, Sigma)包被的玻璃盖玻片上, 质粒瞬时转染按LipofectAMINE产品说明书进行。

Fig.1 Schematic diagram of construction of Stat3 cDNA and reporter gene expression plasmids

1.2.3 免疫细胞化学染色 细胞转染后48 h, 以4% PFA固定30 min, 1% Triton X-100通透细胞膜1 min后, 按文献[15]方法染色。 封片前以DAPI (2 mg/L)避光染色7 min。 一抗为1∶200稀释的Stat3(C-20)多克隆抗体; 以正常兔血清IgG (Zymed)为阴性对照。 荧光标记二抗为1∶200稀释的LRSC-羊抗兔IgG (Dainova)。

1.2.4 X-gal染色 细胞转染后48 h, 以含1％ 甲醛, 0.2％ 戊二醛的PBS固定3～5 min, PBS洗两次后, 在X-gal染液(1 g/L X-gal、 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]、 5 mmol/L K4[Fe(CN)6]、 2 mmol/L MgCl2)中37 ℃避光显色1～2天, 显色后于2% 甲醛中固定30 min, 4 ℃保存。

1.2.5 免疫沉淀和蛋白质免疫印迹反应 按文献[16]收集COS7细胞总蛋白, 并用Stat3多抗进行免疫沉淀。 再以Stat3(C-20)(1∶1000, Santa Cruz)和phospho-Stat3 (Tyr705)抗体(1∶500, New England Biolabs)进行免疫印迹反应。 二抗为羊抗兔IgG-碱性磷酸酶(1∶500, Zymed)。 NBT和BCIP底物显色。

2 结果(Results)

2.1 活性Stat3蛋白在COS7细胞中的表达

利用免疫细胞化学方法, 我们首先考察了COS7细胞中Stat3蛋白的表达情况。 我们发现, Stat3蛋白在COS7细胞有表达 [图2(A)]。 在高倍镜下, 可见Stat3蛋白在细胞质中均匀分布, 而在细胞核中的表达较细胞质中为高[图2(B)]。 以正常兔血清进行细胞免疫染色, 无阳性信号产生(结果未显示)。

在介导细胞因子和生长因子刺激的信号转导过程中, Stat3通过其705位酪氨酸的磷酸化而被激活。 因此, Stat3Y705是Stat3蛋白的活性形式, 而phospho-Stat3(Tyr705)抗体可特异识别这种形式。 Stat3Y705抗体的免疫印迹反应显示, 在COS7细胞的裂解液中仅能检测到微弱的92 kD蛋白质条带[图2(E), 泳道3]。 以Stat3(C-20)抗体进行免疫沉淀, 再分别以Stat3和Stat3Y705特异性抗体进行免疫印迹反应后, 在分子量约为92 kD处可看到相应的蛋白质条带 [图2(E), 泳道1、 2]。 这些结果表明, 在COS7细胞中不仅存在Stat3蛋白, 而且存在705位酪氨酸磷酸化的活性Stat3蛋白。

Stat3在被活化后, 通常与Stat1形成异二聚体, 转位到细胞核内, 与STAT特异的DNA反应元件结合, 启动下游靶基因的转录。 我们将Stat3特异识别元件m67串连为四聚体装在报道基因lacZ和EGFP的上游, 制备报道基因质粒4m67lacZ和4m67EGFP。 这些质粒中只含有β-珠蛋白基因的基本启动子, 若没有反式蛋白因子结合在Stat3特异识别元件4m67上, 则报道基因不表达[17]。 因此, 当我们将4m67EGFP质粒瞬时转染入COS7细胞时, 可看到部分细胞内有EGFP的绿色荧光[图2(C)、 2(D), 箭头所示]。 4m67lacZ质粒的瞬时转染也得到相似结果(结果未显示)。 这表明, COS7细胞中存在内源的Stat3活性蛋白, 并且这些活性Stat3蛋白还可在核内与m67顺式元件结合, 诱导报道基因的转录。 以上结果能从Stat3蛋白在细胞内的分布, 该蛋白质705位酪氨酸的磷酸化形式, 以及Stat3蛋白与其特异识别元件的结合活性等三个方面分别证明, COS7细胞中存在活性Stat3 蛋白。

Fig.2 Active Stat3 protein exists in COS7 cells

(A, B) Immunofluorescence staining of COS7 cells with antibody against Stat3 protein. Note that Stat3 protein is present in the cytoplasm and nucleus of COS7 cells. (C, D) 4m67EGFP report gene transfected COS7 cells with DAPI staining of cell nuclei (D), and there is green fluorescence in the transfected cells (C, arrows). (E) Immunoprecipitation and Western blot analysis of Stat3Y705 in COS7 cells. The COS7 cell lysate was immunoprecipitated with Stat3 antibody, and the precipitate was loaded on 7.5% polyacrylamide gel. Then the immunoblotting was carried out with antibodies against Stat3 (Lane 1), and Tyr705-phosphorylated Stat3 (Lane 2) respectively. The COS7 cell lysate was immunoblotted with antibody against Tyr705-phosphorylated Stat3 (Lane 3).

2.2 过量表达Stat3蛋白引起COS7细胞形态的显著变化

为探索Stat3蛋白在COS7细胞中的功能, 首先我们构建了两种Stat3过量表达质粒, Stat3lacZ和Stat3GFP。 在质粒Stat3GFP中, Stat3和GFP cDNA之间存在一个内核糖体进入位点(IRES), 这样可使GFP与Stat3蛋白同时在细胞中表达, 因此可通过GFP的绿色荧光来示踪外源Stat3蛋白的表达。 Stat3GFP质粒瞬时转染COS7细胞后, 用Stat3抗体免疫荧光染色, 发现在这些转染的细胞中 [图3(A), 楔形箭头所示], Stat3蛋白的表达相对于未转染Stat3GFP的细胞 [图3(A), 双箭头所示]大大增强。 同时在Stat3蛋白高表达的细胞中, 可观察到绿色荧光蛋白的表达 [图3(B), 楔形箭头所示]。 同样, 用Stat3lacZ质粒转染COS7细胞也可检测到Stat3蛋白的过量表达(结果未显示)。

为考察过量表达的外源Stat3蛋白是否具有转录激活活性, 我们在COS7细胞中共转染报道基因质粒4m67lacZ 和过表达质粒Stat3GFP, 并以单转染4m67lacZ报道基因质粒为内源Stat3蛋白的活性对照。 X-gal染色结果显示, 在转染4m67lacZ质粒的COS7细胞中, 可看到内源Stat3蛋白启动的报道基因lacZ的表达, X-gal染色为浅蓝色<