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ISSN 0582-9879                                          ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 723–727                                    CN 31-1300/Q

Separation of Hydrophobic NAD(P)H Dehydrogenase Subcomplexes from Cyanobacterium Synechocystis PCC6803

DENG Yong, YE Ji-Yu, MI Hua-Ling*, SHEN Yun-Gang

( State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China )

 

Abstract        Many efforts have been paid to the separation of an integrated NA(D)PH dehydrogenase (NDH) complex. Several hydrophilic subcomplexes of NDH have been purified from the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. However, no hydrophobic NDH subcomplex has ever been separated from cyanobacteria yet. In this paper, two NDH subcomplexes were separated from n-dodecyl β-D-maltoside(DM)-treated whole cell extracts of Synechocystis PCC6803 by anion exchange chromatography and gel filtration. Both subcomplexes contained the hydrophobic subunit NdhA, suggesting that they were hydrophobic NDH subcomplexes. Of the two subcomplexes, only one subcomplex contained NdhH. These subcomplexes showed NADPH-nitroblue tetrazolium (NBT) oxidoreductase activity and could specifically oxidize NADPH when several quinone analogues were used as electron acceptors, such as ferricyanide, 2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone (DBMIB), 2,6-dichlorophenol indophenol (DCPIP), duroquinone, ubiquinone-0 (UQ-0), etc.

 

Key words     Synechocystis; NAD(P)H dehydrogenase; hydrophobic subunit

_________________________________________

Received: March 24, 2003     Accepted: June 2, 2003

This work was supported by the grants from the Major State Key Basic Research Development Program of China (973 Program) (No. G1998010100) and the National Natural Sciences Foundation of China (No. 30270123)

*Corresponding author: Tel, 86-21-64042090-4513; Fax, 86-21-64042385; e-mail, mihl@iris.sipp.ac.cn

 

集胞蓝藻PCC6803含疏水亚基的NAD(P)H脱氢酶亚复合体的分离

邓勇    叶济宇     米华玲*    沈允钢

( 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、 植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032 )

 

摘要       利用离子交换与凝胶过滤层析, 从n-dodecyl β-D-maltoside(DM)处理的集胞蓝藻Synechocystis PCC6803细胞粗提液中, 首次分离到两个包含NDH疏水亚基NdhA的亚复合体。 酶活性分析表明, 分离到的NDH亚复合体具有NADPH-氮蓝四唑(NBT)氧化还原酶活性, 以NADPH为电子供体可以还原铁氰化钾、 二溴百里香醌(DBMIB)、 二氯酚靛酚(DCPIP)、 duroquinone以及UQ-0等质醌类电子受体。

 

关键词   集胞蓝藻; NAD(P)H脱氢酶; 疏水亚基

 

集胞蓝藻Synechocystis PCC6803的基因组包含11个ndh基因(ndhA～K)[1], 它们都编码一个与线粒体复合体I高度同源的NAD(P)H脱氢酶(NDH, EC 1.6.99.3)[2]。 在蓝藻中, NDH是一个多亚基复合体, 已知其ndhA～G和ndhH～K基因分别编码NDH的疏水亚基和亲水亚基[2,3]。

有证据表明蓝藻NDH既位于质膜也位于类囊体膜上[2], 分别介导呼吸和光合循环电子传递[4,5]。 NDH介导的电子传递参与无机碳转运系统的能化/活化[6～8]以及蓝藻对盐胁迫的适应[9,10]等生理过程。 此外, ndhH基因的缺失分析表明Ndh H亚基对于蓝藻的生存是必需的[11]。 最近, 我们发现蓝藻中NADPH专一的NDH参与光调节的围绕光系统I的循环电子传递及呼吸电子传递, 而且NDH的活性和亚基表达也受光诱导[12]。

蓝藻NDH复合体的分离纯化比较困难。 其主要的原因是, 在分离纯化过程中常常得到几个不同的、 具有酶活性的亚复合体。 此外, 也有报道指出, 蓝藻中可能存在不同功能形式的NDH[7,13]。 至今为止, 人们还没有从蓝藻中分离到完整的NDH复合体。 Berger等[3]用免疫亲和层析的方法, 从集胞蓝藻PCC6803类囊体膜的Triton X-100溶出物中分离到一个NDH的亚复合体, 包含7条主要的多肽, 其中有Ndh H、 I、 J、 K等亲水亚基。 Matsuo等[14]从兼性离子去污剂3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) 处理的集胞蓝藻PCC6803的细胞粗提物中, 也分离到一个对NADPH专一的NDH亲水亚复合体, 包含Ndh H、 I、 J和K亚基, 但不含Ndh A和Ndh B等疏水亚基。 迄今, 含疏水亚基的蓝藻NDH亚复合体的分离还未见报道。 研究表明线粒体呼吸链复合体I的疏水亚复合体可能含有醌结合位点[15], 由于蓝藻NDH与线粒体复合体I有很高的同源性, 可以推测蓝藻可能也是如此, 但还没有直接的实验证据。 因此, 从蓝藻中分离NDH的疏水亚复合体对研究NDH复合体的结构与功能具有重要意义。

本文利用离子交换层析和凝胶过滤, 首次从集胞蓝藻PCC6803中分离到含疏水亚基的NDH亚复合体, 并对此亚复合体的性质进行了初步的研究。

 

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   细胞的培养

集胞蓝藻PCC6803细胞用BG-11培养基[16](含5 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0), 在30 ℃、 连续光照(60 μEm－2s－1)下通气(含2% CO2的空气)培养。 对数后期生长的细胞 (A730=0.4～0.6)于5000 g 离心5 min收集, 细胞以10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)洗涤一次, 再次离心, 将蓝藻细胞悬浮于含20%(体积比)甘油的10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中, 贮存于－80 ℃。

1.2   蛋白质的分离

细胞冻融后加入0.5 mmol/L苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 用Bead-beater细胞破碎器(Biospec, 日本)在冰浴中破碎, 每次破碎20 s, 间歇3 min, 重复5个循环。 细胞匀浆于10 000 g、 4 ℃离心5 min以除去未破碎的细胞, 上清液(细胞粗提液, 蛋白质浓度调节到25 g/L)中加入5 g/L(最终浓度)十二烷基麦芽糖苷(n-dodecyl β-D-maltoside, DM), 冰浴中缓慢振荡1 h, 最后以140 000 g离心60 min。 离心后上清液先经DEAE-52(Whatman)离子交换柱(2.5 cm×15 cm)分离, 用含0 ～ 0.5 mol/L NaCl线性梯度的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 0.5 mmol/L EDTA, 在7 ℃洗脱(流速为3 mL/min, 12 mL/管)。 得到的活性部分用Amicon YM-10超滤膜浓缩, 然后再用两支串联的Hiload 26/60 Superdex 200 prep grade凝胶过滤柱(2.6 cm×60 cm), 于10 ℃在高压液相层析(FPLC)系统(Amersham Pharmacia)上分离蛋白质, 洗脱液含10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 0.5 mmol/L EDTA、 150 mmol/L NaCl, 流速为1 mL/min。 收集的活性部分以Amicon YM-30超滤膜浓缩后－80 ℃贮存。

1.3   NDH酶活性分析

NDH酶活性通过测量人工电子受体的还原或底物NADPH的氧化来分析[14]。 NADPH的氧化用分光光度计(岛津UV-3000)记录340 nm [ε=6.22(mmol/L)－1 ·cm－1] 光吸收的下降速率来测量, 当铁氰化钾为电子受体时记录 420 nm [ε=1.03(mmol·L)－1·cm－1]处光吸收下降速率来测量。 测量温度为室温(约25 ℃)。 1个酶活性单位为每分钟氧化1 μmol/L NADPH的酶量。

1.4   非变性凝胶电泳及活性染色

凝胶过滤分离到的活性部分直接进行非变性凝胶电泳(native-PAGE)分析, 按Davis等[17]的方法用7.5%聚丙烯酰胺凝胶于4 ℃下进行。 活性染色时将凝胶于室温、 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)中缓慢摇动5 min, 然后暗中加入含1 g/L氮蓝四唑(NBT)及1 mmol/L NADPH的20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5), 直至紫色条带呈现。

1.5   蛋白质的洗脱、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及免疫印迹分析

将多个非变性凝胶上的活性条带切下后, 置于约1倍凝胶体积的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1% (体积比) Triton X-100和0.1 g/L SDS中30 ℃振荡过夜, 然后10 000 g离心10 min, 上清液以15% SDS-PAGE分离并用于免疫印迹分析。 Ndh A抗体由Asada教授(日本福山工业大学)惠赠, Ndh H抗体由Ogawa教授(日本名古屋大学)惠赠。

Fig.1       Separation of NDH from the whole cell extracts of Synechocystis PCC6803

(A) Anion exchange chromatography. (B) Gel filtration.

 

Table 1   Procedure of the separation of NDH Purification step〖〗 Protein

Purification step

Protein

(mg)

Total activity

(μmol NADPH min-1ml-1)

Specific activity

[μmol NADPH min–1 (mg protein)–1]

Purification

(fold)

Yield

(%)

Crude extract (before DM treatment)

496

123

0.249

1

100

Crude extract (after DM treatment)

481

120

0.250

1

97

DEAE52

125

65

0.522

2.1

25

Superdex 200

5.5

29

5.29

22

1.1

 

2    结果(Results)

NDH复合体的分离过程见表1。 蓝藻细胞粗提液经5 g/L DM增溶后, 经离子交换层析分离, 集中在0.18～0.31 mol/L NaCl梯度洗脱范围分离到一个主要的NADPH-铁氰化钾氧化还原酶活性峰[图1(A)]。 将这部分活性峰处的蛋白质再经凝胶过滤层析分离后, 得到四个不同分子量的酶活性部分[图1(B)]。 由于我们希望得到分子量尽可能大的NDH亚复合体, 因此我们主要对图1(B)中的第一个活性峰进行了分析。 第一个活性峰的蛋白质经非变性凝胶电泳及活性染色后, 主要出现了三条活性条带, 分子量分别为240 kD (带I)、 200 kD (带II)和100 kD (带III), 考马斯亮蓝染色后在相同位置有对应的三条蛋白质带。 由于带III分子量较小, 活性较低, 而且其量随带I和带II的变化而变化 (图2), 因此我们推测它可能是从带I或者带II降解下来的, 然而也不能排除其是另一种NDH亚复合体的可能。 带I、 II和III都不能氧化NADH(数据未列出), 表明我们分离得到的复合体是NADPH专一的。

Fig.2       Native-PAGE and NADPH-NBT oxidoreductase activity staining of the activity peak fractions separated by gel filtration

(A) Stained with Coommassie brilliant blue. (B) NADPH-NBT oxidoreductase activity staining.

 

带I和 II中的蛋白质切带溶出后, SDS-PAGE 分析显示它们分别含有14和13条蛋白质带, 其中带I与带II的多肽组成大部分相同[图3(A)], 表明分子量较小的带II可能是从带I上降解来的; 然而, 也不排除它们是两种分子组成有所不同的NDH的可能。 免疫印迹分析结果显示, 带I含Ndh A和Ndh H; 带II含Ndh A, 但不含Ndh H[图3(B)]。 此外, 从图3(A)可以看出有三条很浓的蛋白质带, 分子量分别为48 kD、 21 kD和18 kD, 分别与相应藻胆体蛋白的分子量一致[18]。 我们在另一份工作中发现蓝藻中NDH与藻胆蛋白结合在一起(未发表数据), Matsuo等[14]在分离的蓝藻NDH中也发现藻胆蛋白的存在, 因此我们推测这三种蛋白质可能为藻胆体蛋白。 在这两个NDH亚复合体中, 我们没有检测到Ndh B、 Ndh K及铁氧还蛋白-NADP+ 氧化还原酶(FNR)的存在。 此外, 在离子交换层析前, 用非变性凝胶电泳及活性染色分析了细胞粗提液, 我们检测到一个300 kD的NDH亚复合体, 含有Ndh A、 Ndh B和Ndh H(数据未列出), 然而本文中分离到的两个NDH亚复合体都不含Ndh B, 我们推测Ndh B可能在分离过程中从NDH复合体上脱离下来了。

由带I和带II在离子交换、 凝胶过滤层析及电泳中的行为可以看出它们在分子量及电荷等蛋白质性质上非常接近, 用本实验中采用的离子交换、 凝胶过滤层析方法我们无法把它们分开; 尽管非变性电泳可以将他们分开, 但在从胶上洗脱蛋白质时, NDH亚复合体降解严重。 此外, 我们还发现, NDH的结构很不稳定, 细胞粗提液于30 ℃处理1 h, 300 kD的NDH即大部分消失, 同时伴随240 kD和200 kD两条NDH活性条带的增加, 其分子量大小分别对应带I和带II(数据未列出)。 因此我们推测带I和带