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http://www.abbs.info e-mail:abbs@sibs.ac.cn ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 761–767
CN 31-1300/Q |
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Short Communication |
Expression and Characterization of Kringle 1－5 Domains of Human Plasminogen
ZHOU Qing-Wei, XIE Jing-Li1, XIN Li, YE Qin1, LI Zai-Ping, GAN Ren-Bao*
( Institute of Biochemistry and Cell
Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of
Sciences, Shanghai 200031, China; 1State Key Lab of Bioreactor of
East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China )
Abstract The cDNA encoding Kringle
1－5 domains of human plasminogen
(designated as K1－5), obtained from HepG2 by
RT-PCR, was cloned into expression vector pHIL-S1. The recombinant plasmid
pHIL-K1－5 was transformed into Pichia
pastoris GS115 and the recombinant yeast was induced by methanol to express the
recombinant protein. The expressed protein was purified by lysine affinity
chromatography. The recombinant K1－5
inhibited the growth of bovine aortic endothelial cells (BAEC) stimulated by
the basic fibroblast growth factor (bFGF), in a dosage-dependent manner, with a
half maximal concentration of 14 mg/L. And rhK1－5
inhibited 47% of the BAEC migration stimulated by bFGF at the concentration of
50 mg/L. rhK1－5 also affected the cell cycle
of BAEC and caused G0-G1 arrest at the concentration of 14 mg/L.
Key
words K1－5; Pichia pastoris; expression;
purification; bioactivity
_________________________________________
Received:
April 10, 2003 Accepted:
May 15, 2003
*Corresponding
author: Tel, 86-21-54921102; Fax, 86-21-54921011; e-mail, rbgan@sibs.ac.cn
人纤溶酶原Kringle
1－5结构域的表达及活性鉴定
周庆玮 谢静莉1 辛利 叶勤1 李载平 甘人宝*
( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031;1华东理工大学生物反应器国家重点实验室, 上海 200237 )
摘要 利用RT-PCR的方法从人肝癌细胞株HepG2细胞内获得了编码人纤溶酶原(hPlasminogen) 的Kringle
1到5 (简称K1－5)的cDNA, 将其克隆到表达载体pHIL-S1中。
将重组载体pHIL-K1－5转化毕赤酵母GS115,
得到的重组菌株用甲醇进行诱导表达, 并利用赖氨酸亲和柱纯化重组蛋白质。 重组蛋白质K1－5能特异性地按剂量依赖的方式抑制碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的牛主动脉内皮细胞(BAEC)的增殖, 浓度为14
mg/L时达到最大抑制效果的50％; K1－5能抑制bFGF引起的BAEC的迁移, 50 mg/L的K1－5对BAEC迁移的抑制率为47％;
K1－5还能影响BAEC细胞的周期,
14 mg/L的K1－5使细胞在G0～G1期积聚。
关键词 K1－5; 毕赤酵母; 表达;
纯化; 生物活性
20世纪70年代, 哈佛大学的Folkman教授提出： 肿瘤的生长与血管生成密切相关[1,2]。
他提出了一种新的治疗肿瘤的方法： 通过抑制血管生成抑制肿瘤生长。
这为治疗肿瘤提供了一种新的思路[3]。
许多实验证明了肿瘤的生长和迁移依赖于血管的形成[4～6]。 血管抑素(angiostatin)是O’Relly等[7]在1994年发现的第一个内源性的血管抑制因子, 它在体外能特异性地抑制血管内皮细胞的增殖和迁移, 并能抑制多种肿瘤的生长和转移[8]。 由于血管抑素(angiostatin)作用专一性强, 无毒性耐药性的产生,
因而一度成为肿瘤治疗药物的开发热点[9], 目前美国EntreMed公司研制的血管抑素(angiostatin)已经进入二期临床。
序列分析表明血管抑素(angiostatin)是纤溶酶原水解后的产物, 它包含人纤溶酶原(hPlasminogen)的前4个Kringle结构(图1)。
Kringle结构是由约80个氨基酸组成的内部含有3对二硫键的圆饼状结构域,
对赖氨酸有很高的亲和力, 存在于很多蛋白质中[10]。 研究发现[11,12]纤溶酶原的5个Kringle结构单独作用时,
抑制内皮细胞生长的活性各不相同, 它们的活性的高低依次为K5、
K1和K3, K2活性不高, 而K4基本没有活性; 另外,
Kringle 1－5各个组合后也具有不同的抑制内皮细胞生长的活性： K2－3 抑制活性和K2相似, K1－3活性大于K1－4。
重组K4－5也能显著抑制BCE细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管的生成[13]。
表1比较了一系列Kringle结构域的生物活性,
以达到最大抑制效果50％时的作用浓度(ED50)表示。
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Fig.1 Schematic structure of
plasminogen |
Table 1 Bioactivity of
different Kringle domains of human plasminogen
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序列分析结果表明,
纤溶酶原中的第五个Kringle结构域(K5)和其他4个Kringle结构(K1～K4)在一级结构的同源性分别为57.5％、 46.25％、
48.75％和52.％(图2)。
本实验室发现人肝细胞生长因子的第一个Kringle结构域(HGFK1)与纤溶酶原的Kringle结构域序列同源性较高, 将其克隆表达后发现它具有较强的抑制内皮细胞生长的能力[14]。 另外, 纤溶酶原经尿激酶激活后生成一个新的血管生成抑制剂, 它包括纤溶酶原的Kringle
1－4及部分Kringle 5结构(简称K1－4.5),
具有较高的生物活性, 是一个很有潜力的血管生成抑制剂[15]。 我们实验室克隆了K1－4.5的基因, 将其在毕赤酵母GS115中进行分泌表达, 发现K1－4.5活性与血管抑素接近[16]。
到目前为止, 对于完整的Kringle 1－5基因的克隆表达和生物活性未见报道。
Fig.2 Sequence alignment of the five plasminogen Kringle domains of human plasminogen
本文应用PCR方法扩增人纤溶酶原Kringle 1－5(简称K1－5)的cDNA, 克隆到毕赤酵母表达载体pHIL-S1中, 以分泌蛋白质的形式在毕赤酵母GS115中进行表达, 将表达上清液通过赖氨酸-Sepharose 4B层析柱纯化, 得到的重组蛋白质用牛主动脉内皮细胞(BAEC)测定其生物活性。 我们发现,
K1－5能按剂量依赖的方式抑制bFGF刺激的BAEC的增殖, 并能抑制BAEC的迁移和影响BAEC的细胞周期。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 细胞和菌株 大肠杆菌Top10F和毕赤酵母菌株GS115
(His4, Mut+) 购自Invitrogen 公司; 人肝癌细胞株HepG2为中科院生化细胞所保存; 牛主动脉内皮细胞(BAEC)为上海中医药大学惠赠。
1.1.2 毕赤酵母表达载 体表达载体pHIL-S1购自Invitrogen
公司。
1.1.3 试剂盒及主要试剂和材料 SuperScript
RNase H－反转录试剂盒购自TaKaRa公司; pfu Taq聚合酶购自生工公司;
DNA凝胶电泳回收试剂盒购自博彩公司; 消解酶(Zymolase)100T购自Invitrogen 公司;
MTT及限制性内切酶和连接酶均购自华美公司; 电转杯购自Bio-Rad公司;
细胞培养基购自Gibco BRL公司; 酵母抽提物、
Polypepton以及酵母氮碱均购自DIFCO公司; PI染料购自华舜生物工程有限公司, 其他试剂均为国产分析纯; X光片购自Kodak公司;
Transwell购自强生公司。
1.1.4 引物合成和DNA序列测定 DNA引物由塞百盛公司合成并经PAGE纯化,
DNA序列测定由联合基因公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞总RNA的提取 采用Gibco BRL公司的Trizol试剂, 按说明书操作。
1.2.2 RT-PCR扩增 目标序列以总RNA为模板,
K1－5特异引物1和引物2进行RT-PCR。 45 ℃温育30 min, 进行逆转录, 条件如下：
94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 70 ℃延伸90
s。 共进行35个循环。
引物1： 5'-TTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCT-C-3'
引物2： 5'-ATCAAATGAAGGGGCCGCACAC-3'
1.2.3 PCR扩增用于构建表达载体的DNA片段以RT-PCR产物为模板, 用引物3和引物4进行PCR反应扩增用于构建pHIL-S1表达载体的DNA片段。 反应条件为： 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30
s, 72 ℃延伸90 s。
共进行30个循环。
引物3：
5'-ATCGCTCGAGCGTTATTTGAAAAG-AAAGTGTATCTC-3' (斜体下划线部分为XhoI酶切位点)
引物4： 5'-ATCGAATTCTAATCAAATGAAGGG-GCCGC-3' (斜体下划线部分为EcoRI酶切位点)
1.2.4 PCR产物的克隆和鉴定 PCR扩增的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳后回收, 分别用XhoI和 EcoRI酶切,
经回收后连接到经XhoI和 EcoRI酶切处理的载体pHIL-S1上。
将连接产物转化大肠杆菌Top10F后, 以XhoI和EcoRI双酶切鉴定。 将得到的阳性克隆pHIL-K1－5进行 DNA序列测定。
1.2.5 重组质粒电转化 毕赤酵母GS115将10
μg构建好的载体pHIL-K1－5用BglII酶切3～4 h, 酚-氯仿抽提, 乙醇沉淀后溶于10
μL无菌水中备用。 将GS115甘油菌划线于YPD平板,
30 ℃培养48 h后挑取单克隆到3 mL YPD液体培养基中,
30 ℃、 200 r/min培养过夜。 取10～50 μL过夜菌接入新鲜的50 mL YPD液体培养基中,
30 ℃、 200 r/min培养至A600介于1.3～1.5。 将菌液于1500 g、
4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 菌体重悬于50 mL无菌水中, 于1500
g、 4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 重复洗涤一次。 菌体重悬于2 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇中,
1500 g, 4 ℃离心5 min, 倾去上清液。 菌体重悬于0.1 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇中。 取5 μg处理好的质粒加入经上述处理的80 μL感受态细胞中, 冰浴5
min, 以25 μF/1500 V的条件电击,
加1 mL冰冷的1 mol/L D-山梨醇,
取适量涂于MD平板, 30 ℃培养至克隆长出。
1.2.6 阳性酵母转化子的鉴定 从转化平板上挑取单克隆, 转接在新鲜的MD平板上, 30 ℃培养48
h。 分别挑取单克隆浸入10
μL浓度为3 g/L的消解酶(Zymolase)中, 室温放置10
min后, 放入液氮中冻结。 室温下解冻后, 各取5 μL作为PCR反应的模板,
使用引物5和引物6 进行PCR鉴定。 反应条件为： 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30
s, 72 ℃延伸90 s。
共进行30个循环。
引物5： 5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ (5