吴蕾1, 黄明辉2, 赵建龙1*, 杨梦苏1,2*
1. 中科院上海微系统与信息技术研究所，上海长宁路865号
2. 香港城市大学生物化学系，香港九龙达之路
摘要 本文用表面等离子体共振技术研究M-MLV RT-和固定在传感器芯片表面的DNA（单链DNA，模板／引物 DNA 复合物）之间的结合，并用该技术研究几种化合物对此结合的影响，得到了结合和解离动力学常数，并由此计算结合的亲和力常数。DNA通过链霉素－生物素之间的相互作用固定在SPR传感芯片表面。构象变化的两态模型很好地与实验曲线拟合，意味着M-MLV RT-与DNA的结合过程存在构象变化。本文还研究了依发韦仑(EFV)、奈韦拉平(NVP)和槲皮素(Q)对M-MLV RT-与模板／引物 DNA 复合物的结合过程的影响。EFV和 NVP 增强了M-MLV RT-与模板／引物 DNA 复合物的结合的亲和力。EFV作用下，结合的亲和力常数为1.50´108M-1，是无EFV时的27倍。分析说明EFV能导致形成紧密的四元复合物EFV-M-MLV RT--P/T。 NVP作用下M-MLV RT与P/T复合物的亲和力增加三倍。以往的研究表面槲皮素影响RT活性，但是我们的研究表明它并不影响M-MLV RT与P/T复合物的结合。
逆转录酶(RT)在逆转录病毒生活史中发挥着重要作用。RT具有以RNA或DNA作为模板合成DNA的聚合酶活性以及RNase H活性，因此它能将病毒的单链RNA基因组反转录、合成双链DNA，最终通过病毒表达的整合酶将双链DNA整合到宿主的基因组。人免疫缺陷病毒 (HIV) 是一种逆转录病毒，它是艾滋病的元凶。抑制RT的聚合酶活性是目前治疗HIV或其他逆转录病毒感染引起的疾病的主要方法。
HIV-1 RT是一个含有p66和p51 两个亚基的二聚体。这两个亚基都含有所谓的“手指”，“手掌”，“大拇指”及其连接部分。“手掌”部分含有聚合酶的活性位点，而“手指”部分和酶的连续性(processivity)有关。这个手型结构和大多数DNA和RNA聚合酶是非常类似的。在FDA允许允许使用的16种治疗艾滋病的药物中，有10种属于RT抑制剂，其中又进一步细分为核酸抑制剂(NRTIs)和非核酸抑制剂(NNRTIs)。NRTIs是核酸或核苷酸的类似物，能够阻断DNA的延伸反应，而NNRTIs是一些憎水化合物，它们不需要经过细胞代谢而直接作用于RT。结构研究的结果表明NNRTIs结合到距离聚合酶活性位点大约10 Å的憎水口袋里面。[1, 2] 稳态动力学实验的结果非核酸抑制剂与RT的结合和模板/引物与RT的结合之间是非竞争关系[3, 4]。 尽管有大量文章述及NNRTIs的作用机理，NNRTIs作用下RT与DNA相互作用的动力学机理仍不清楚。
当研究者们从大量合成的化合物中筛选有效的RT抑制剂的时候，另外有研究者致力于从天然产物中筛选有活性的抗-HIV化合物[5-8]。通过体外实验，他们找到一些抑制HIV-1 RT和RLV RT的化合物，其中包括属于黄酮的槲皮素（quercetin）、杨梅树皮素（myricetin）、黄芩素（baicalein）和quercetagenin。然而，还没有相关的报道论述是否这些黄酮直接作用于RT并且它们与RT如何相互作用。
表面等离子体（SPR）生物传感器被证明是一个很好的用来研究生物大分子之间相互作用的工具，通过它我们能够获得相互作用时量化的动力学和热力学的信息。如果溶液中的配体与固定在传感芯片表面的相应的生物分子发生特异的相互作用，就会改变芯片表面的折射率，从而转化为SPR信号被SPR传感器检出。一定范围内，相互作用的快慢和强弱与SPR信号之间存在对应关系。SPR技术与其它研究生物分子之间相互作用的方法相比，有许多优点，如：（１）不用标记生物分子；（２）能够实时检测生物分子之间的相互作用；（３）是一种无损伤检测方法。一些研究者已经将SPR技术用于研究DNA聚合酶与DNA底物的相互作用[9-12]。
本文用重组的失去活性的鼠莫洛尼氏白血病毒逆转录酶( M-MLV RT-)建立用SPR技术研究与的相互作用的模型系统，并研究已知的抑制剂（Efavirenz,EFV; Nevirapine,NVP）和可能的抑制剂 (Quercetin,Q) 对RT与DNA底物相互作用的影响。本文给出了能够比较好地描述M-MLV RT- 与单链DNA，模板/引物DNA复合物（DNA T/P complex）的动力学模型以及相应的动力学常数和亲和常数，同时讨论了几种抑制剂作用下结合的动力学模式并计算相应的常数。
M-MLV RT-是一个分子量为78kDa的单体，我们选用这个酶是因为它与HIV-1 RT相比具有很相似的右手构象。就“手指”和“手掌”的结构来说，M-MLV RT-除了在N末端多了16个残基外，它与HIV-1 RT是非常相像的。M-MLV RT-多出来的几个残基防止酶被蛋白酶降解和二聚化[2]。两个酶的聚合酶活性位点都位于“手指”和“手掌”的连接部分包括了三个高度保守的与聚合酶活性发挥紧密联系的天冬氨酸残基。因为两种酶在结构上的较高的同源性，通过在分子水平研究RT抑制剂对RT活性的影响可以帮助我们开发新的HIV-1 RT的抑制剂。
生物传感器芯片CM5 (research grade)、HSB-EP 缓冲液和氨基偶合试剂包括N-羟基丁二酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）, N-乙基- N'-（3-二甲胺基丙基）碳二亚胺盐酸盐（N-ethyl-NP-(3-diethylaminopropyl) carbodiimide，EDC）和盐酸乙醇胺购自Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Sweden). Streptavidin 购自 Sigma (St Louis.MO. U.S.A.). 固定前Streptavidin溶于10 mM 乙酸钠（pH4.8）。
RNase H domain 缺失的M-MLV RT( SuperScript II RT) 购自 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad. CA. U.S.A)。考马斯蓝沾染的SDS-PAGE分析表明蛋白的纯度大于95%。Invitrogen Life Technologies 提供了M-MLV RT-的浓度。
Bristol-Myers Squibb Company ( Princeton. NJ. U.S.A.) 慷慨地赠予了efavirenz (EFV)，而 nevirapine (NVP)获赠于Desano Company (Shanghai, China)。槲皮素(Q) 购自同田生物科技公司 ( Shenzhen, China ).
5’端标记生物素的寡聚脱氧核糖核酸和非生物素标记的互补链在上海生工(Sangon, Shanghai, China)合成并且经过HPLC纯化，具体序列表示如下：
Single-stranded DNA template (ssDNA)
5’-biotin-GCATCAACGCACGTTAGCGACTGATACCAAGACTG CCCTTGGACGGCTGC-3’
DNA template-primer complex (T/P complex)
5’-biotin-GCATCAACGCACGTTAGCGACTGATACCAAGACTG CCCTTGGACGGCTGC-3’
3’- CGTAGTTGCGTGCAATCGCTGACTATG GGGAACCTGCCGACG-5’
为了让互补双链严格退火，含有互补双链的HSM (0.01M HEPES, 0.15M NaCl, 0.01M MgCl2, pH7.4)溶液先在99°C 孵育5分钟，然后缓慢降至室温。最终，15-mer和27-mer按照碱基互补配对原理与50-mer的模板形成中间含有8个碱基空位的模板/引物DNA复合物。
CM5芯片首先用streptavidin 按照BIAcore AB 提供的标准程序(参见http://www.biacore.com)修饰。由于1000 RU对应于每平方毫米的表面固定了1 ng 的蛋白，根据蛋白固定前后RU的变化值，大约1.4´10-14mol/mm2 streptavidin 被固定Fc1和Fc2两个通道对应的传感器芯片表面。利用生物素和streptacidin之间的强相互作用， 标记了的单链DNA和T/PDNA复合物被固定在streptacidin修饰了的Fc1通道对应的芯片表面，而Fc2作为参考通道。最后，大约3´10-14mol/mm2 DNA 底物被固定在芯片表面。
所有的SPR检测均是在 BIAcoreX (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden).上完成。SPR生物传感器的基本原理细节参见文献[13]. 简言之，以玻璃为基片的金膜能够耦合某个角度入射的单色偏振光，产生表面等离子共振，此时能量在金膜上传播而不发生光的反射，这个角度称为表面等离子共振角。流过传感芯片的溶液里的物质如果与固定在芯片表面或芯片修饰介质层中的生物分子结合，就会改变金膜表面的折射率，从而使表面等离子共振角迁移，通过实时测量角迁移的数值我们可以得到固定的生物分子和溶液相中生物分子相应配体结合的量化信息。
文中提到的所有实验均在25ºC下完成，分析物溶于HSM缓冲液，分析溶液的流速是 5mL/min。 在所有的结合实验中，没有固定DNA的传感芯片表面被用做参考表面以减少或避免分析物异质性、分析物与芯片表面的非特异性结合和流过不同溶液时溶液变化造成的误差。
进行结合实验时，含有不同浓度M-MLV RT-的 10mL HSM 溶液注入流体通道与芯片表面固定的DNA分子反应120s，接着让HSM溶液流过芯片表面持续200s，然后以流速10mL/min注入10mL 1%SDS-HSM 解离与DNA 结合的RT，等基线基本回到RT溶液注入前时进行下一个浓度的RT溶液的注入。
EFV, NVP 和Q的水溶性都很差，所以我们用DMSO溶解这些化合物制备成100mM的储液。实验时用HSM稀释所需的浓度，所有实验中分析溶液中含有的DMSO不超过0.1%。
为了检测 M-MLV RT-在药物作用下与T/PDNA复合物的结合过程，用HSM稀释的不同浓度的M-MLV RT-首先和恒定浓度的化合物充分混和，然后将此混合物注入SPR传感器与固定在传感芯片表面的DNA底物反应120s, 接着让HSM溶液流过芯片表面持续200s，然后以流速10mL/min注入10mL 1%SDS-HSM 解离与DNA 结合的RT，等基线基本回到RT溶液注入前时进行下一个浓度的RT溶液的注入。化合物的浓度由预实验决定，让含有不同浓度化合物和固定浓度的M-MLV RT-溶液流过芯片表面，发现分析溶液中含有50mM化合物时RT与DNA反应曲线有明显的差异并且非特异性吸附可以被忽略，因此固定化合物的浓度为50mM进行实验。
因为实验中化合物的浓度远远大于M-MLV RT-的浓度（大于250倍），而且小分子的化合物能够很快地与RT结合，我们认为结合反应发生时RT已经被化合物饱和，分析溶液中极少量的自由酶可以被忽略。
所有的实验数据用BIAevaluation 软件 (version4.1, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)分析。BIAevaluation 软件所采用的数值积分算法对初始参数的设置很敏感，容易造成拟合数据与真实值之间的偏差。偏差的产生一般是由于溶液中物质到芯片表面的传质效应以及结合位点的异质性，为了尽量减小或避免偏差，我们用直接的全局曲线拟合方法（globally fitting）分析数据，并尝试了各种可能的动力学模型[14]。在比较了各种拟合模型的Chi2后，我们选取两种拟合较优的两种动力学模型进行分析。这两种模型－1:1 Langmuir结合模型和两态反应（构象变化）模型分别表示如下。
1:1 Langmuir结合模型
两态反应（构象变化）模型
因为我们的SPR系统连续流过缓冲液时，基线偏移的典型值是0.02RU/s，所以我们在所有的数据分析过程中都考虑基线偏移。算得到的基线漂移值小于0.5RU/s，不会影响数据分析的可靠性。
分析的数据点选自相同的时间区域，取结合过程中的60s和解离过程的100s检测到的数据点进行分析。
生物素和streptavidin之间的结合强度接近于共价结合，结合的解离常数(kd) 是10-15 mol。每次实验后，通过两者结合而固定的DNA几乎不从传感芯片表面洗脱。
含有M-MLV RT-的分析溶液注入传感器后，通过比较修饰有DNA和仅仅固定streptavidin的响应曲线可以检测非特异性吸附是否会影响RT与DNA的相互作用的检测。Fig1.中显示了一次典型的结合实验曲线，从中我们可以看到M-MLV RT-和只修饰有streptavidin的表面有微弱的，可以被忽略的非特异性吸附；当M-MLV RT-经过修饰有DNA的表面时可以检测到明显的结合和解离曲线。将分析表面（固定有DNA）上产生的SPR信号减去参考表面（仅固定有streptavidin）上产生的信号，120nM M-MLV RT-和T/P DNA复合物的结合产生了330RU的响应信号，这进一步证实了结合的特异性。
SPR传感器实时检测不同浓度的M-MLV RT- 和固定于芯片表面的单链DNA和模板-引物的相互作用如图 (Fig.2,3)，由图可见传感器响应强度随着时间和RT的浓度的增加而增大。近来有研究者考虑SPR传感器检测分析的动力学数据的可靠性，认为溶液与表面的传质效应能够影响正确的动力学数据的获得，他们推荐通过提高流速和减少配体的固定量来消除这一影响。为了获得明显的效果，通常采用大于30mL/min的流速，这意味着需要更多的样品进行实验。另外，减少配体固定量的同时需要考虑仪器的灵敏度。实验中~3´10-14mol/mm2 DNA复合物被固定在芯片表面，尝试了5mL/min, 10mL/min, 20mL/min等流速，并未观察到响应曲线的明显差异。同时，考虑传质效应的动力学模拟不能很好地拟合数据（c2 值都是几十）。因此，我们采用5mL/min 的流速。此流速条件下，M-MLV RT- 与DNA的结合时，芯片表面葡聚糖水溶胶中结合的酶和自由的酶的空间梯度是可以被忽略的。说明M-MLV RT- 与DNA的结合并不是一个很快的过程。
以前RT与DNA结合的机理研究表明RT与模板-引物DNA复合物的结合是一个两步反应，包括最初的结合和相继的构象变化过程[3, 15]. 我们的实验数据分析结果与此结论吻合。文中分析了用1:1Langmuir结合模型和两态反应模型进行拟合的结果。几个浓度M-MLV RT- 与DNA结合和解离常数通过全局拟合分析得到。从散点图中我们看到，两态反应模型是分析M-MLV RT- 与单链DNA或者模板－引物DNA复合物的最优模型。由两态反应模型得到的动力学常数通过Table 1说明。分析两个模型得到了相似的结合常数（ka）和亲和力常数 (KA)，这意味着1:1Langmuir结合模型能大体描述结合的动力学过程，而且构象变化不会影响. 酶和DNA的亲和力。M-MLV RT- 和单链DNA结合的亲和力是它和模板－引物DNA复合物亲和力的八倍，这主要由于RT与单链DNA较快的结合和结合后倾向形成紧密结合的构象。酶与ssDNA 结合的ka1值是酶与P/T复合物结合的三倍,而解离常数(kd2)前者比后者低近一个数量级。
Fig.4说明当分析溶液中缺少(a)和存在(b)3%, (c)1% and (d)0.5% DMSO时M-MLV RT-和模板-引�