An Improved Solid Phase Synthesis
of Human Proinsulin C-peptide

SHI Jia-Hao, LI Jiang, JU Cai-E, CUI Da-Fu*

( Institute of Biochemistry and Cell Biology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 200031, China )

Abstract        Human
proinsulin C-peptide with C-terminal glutamine amide could be prepared through
solid phase method by combining the γ-carboxyl group of glutamic acid with the amino group of MBHA resin.
The protecting groups were cleaved by HF. MBHA resin is relatively inexpensive.
The new method is another way for the preparation of human proinsulin
C-peptide. The preparation human proinsulin C-peptide of analogue using of PAM
resin was also reported.

Key
words     human
proinsulin C-peptide; side chain carboxyl group; MBHA; human proinsulin
C-peptide K

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Received: May 15, 2003Accepted: July
4, 2003

This work was supported by a grant from
Shanghai Center of Research and Development of New Drugs (No. 024319107)

*Corresponding author: Tel, 86-21-54921262;
Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]

人胰岛素原C肽固相合成的改进

石嘉豪     李江    鞠彩娥     崔大敷*

( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海 200031 )

 

摘要              利用谷氨酸的γ羧基与4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂的氨基偶联固相, 合成经HF切割去保护基后形成C端是谷氨酰胺的人胰岛素原C肽。 MBHA树脂相对价格便宜, 此方法是制备人胰岛素原C肽的另一种尝试。 同时, 也用PAM树脂合成了人胰岛素原C肽类似物。

关键词   人胰岛素原C肽; 侧链羧基; MBHA; 人胰岛素原C肽K

Idoy等[1]报道人胰岛素原C肽有改善I型糖尿病鼠血管神经病变的功能, Johansson等[2,3]给予C肽联合胰岛素治疗可使糖尿病人减少尿白蛋白排泄率, 改善肾功能和自主神经功能障碍。 体内外数据显示, C肽可能在胰岛素分泌物的调节中起作用。 高鑫等[4,5]研究结果显示, 人胰岛素原C肽可防止糖尿病鼠所致肾小球细胞外基质积聚导致系膜扩张, 改善糖尿病肾病变之形态与功能作用, 这为探索糖尿病慢性并发症的治疗提供了新的途径。 糖尿病病人由于并发血管神经病变致残致死, 目前尚无有效药物。 国内外研究显示, 人胰岛素原C肽具有治疗糖尿病血管神经病变的潜在价值。 我们曾报道了用固相法以BOC谷氨酰胺α羧基偶联PAM树脂合成人胰岛素原C肽[6]。

本实验利用谷氨酸γ羧基与MBHA树脂(4-甲基二苯甲基胺)偶联作固相逐步合成法制备了人胰岛素原C肽; 同时也用固相法合成了人胰岛素原C肽类似物即C端延伸一个赖氨酸的人胰岛素原C肽K, 可作为多拷贝表达人胰岛素原C肽中的单元体, 也可作为基因工程中间产物的标准品。

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   材料

BOC-氨基酸购自日本多肽研究所; 三氟乙酸(TFA)、硅胶薄板(TLC)HPTLC-F254为Merck公司产品; 1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)及二环己基碳二亚胺(DCCI)为东京合成工业株事会社产品; N,N-二异丙基乙胺(DIEA)为Sigma公司产品; 430A多肽合成仪、MBHA树脂及BOC-Lys(Clz)OCH2-Pam树脂为PE Applied Biosystems公司产品; 测定C肽和C肽K的免疫试剂盒购自美国DPC公司。

1.2   方法

1.2.1       BOC-Glu-Bzl的合成     称取L-Glu钠盐50 g溶于200 mL(1 mol/L)NaOH中。 称取66 g BOC酸酐溶于125 mL叔丁醇中并滴加入已配制的L-Glu钠盐溶液中, 保持pH 8.5～9.5, 反应1 h。 乙醚抽提除去过量BOC酸酐, 在冰浴下1 mol盐酸酸化(pH 2.0)。 以乙酸乙酯抽提, 浓缩至晶体析出, 得到52 g BOC-Glu。

称取25 g
BOC-Glu, 冰浴下以170 mL无水乙酸乙酯溶解, 缓慢滴加20.6 g DCCI(先溶于40 mL无水乙酸乙酯), 密闭反应过夜。 次日滤去沉淀, 浓缩至晶体析出, 得BOC-Glu酸酐22 g。

BOC-Glu酸酐22 g溶于100 mL苯甲醇, 加入50 mL干乙醚, 滴加二环己胺/乙醚溶液(25 mL二环己胺+50 mL干乙醚)同时加以搅拌, 反应过夜。 次日滤出固体, 以乙醚研磨、干燥后得BOC-Glu-OBzl二环己胺盐27 g, 悬浮于600 mL乙酸乙酯, 加入0.8 mol/L盐酸调至pH 3.0, 搅拌1.5 h。 滤去沉淀, 收集乙酸乙酯层并以水洗3次, 加无水硫酸钠干燥数小时。
滤去无水硫酸钠浓缩至结晶析出, 结晶以无水乙醚洗涤数次, 干燥后得BOC-Glu-OBzl晶体14.38 g。 经测定熔点为92～96 ℃, 符合理论值; 薄板层析显示均一(TLC鉴定展开液:吡啶:醋酸:水:醋酸丁脂:异丙醇＝12:3:4.5:70:28),
得率54％。

1.2.2       人胰岛素原C肽固相合成方法的改进       取MBHA树脂555 mg(0.51 mmol/g), 用DIEA中和去盐酸盐后将BOC-Glu-OBzl(摩尔数相对MBHA树脂过量4倍)以DCCI为缩合剂加HOBT做成活化酯形式, 滤去DCU后缩合上树脂, 然后以50％ TFA/DCM去除BOC保护基, 以10％DIEA中和, 按人胰岛素原C肽氨基酸序列由C端逐个向N端延伸, 各种BOC氨基酸所用的侧链保护基为: Asp(OCHex)、Glu(OCHex)、Ser(Bzl)、Gln(Trt), 以DCM和DMF混合液(体积比为2:1)为缩合溶剂, 每次缩合后以灵敏茚三酮反应检测残余氨基, 以监控合成质量[7]。 肽键缩合完后先以50％ TFA/DCM去除N端BOC保护基, 肽树脂真空干燥除去水分, 取其中1/2肽树脂于0 ℃含有对甲苯酚(捕捉剂)的干燥氟化氢(HF)中处理1.5 h, 将多肽链从树脂上酸解下来, 并去除各种侧链保护基(包括C端Glu的α羧基上的OBzl)。 裂解完成后以干燥乙酸乙酯洗去保护基与捕捉剂, 用0.025 mol/L的NH4HCO3溶液抽提粗肽, 并冷冻干燥得410 mg, 产率为95％。

1.2.3       人胰岛素原C肽K的固相合成          取BOC-Lys(Clz)-OCH2-Pam树脂492.5 mg(0.67 mmol/g), 按人胰岛素原C肽序列由C端逐个向N端延伸。 合成用试剂、各类BOC氨基酸与人胰岛素原C肽的合成相同。 每轮循环开始以50% TFA去除BOC, 再以10% DIEA中和, 一轮循环结束以茚三酮反应检测监控合成质量。
各种BOC氨基酸所用的侧链保护基为: Asp(OCHex)、Glu(OCHex)、Ser(Bzl)。 肽键组装完成后先以50％TFA/DCM去除N端BOC保护基, 肽树脂真空干燥除去水份, 于0 ℃含有对甲苯酚(捕捉剂)的干燥氟化氢中处理1.5 h, 将多肽链从树脂上酸解下来, 并去除各种侧链保护基。 裂解完成后以干燥乙酸乙酯洗去保护基与捕捉剂, 用0.025 mol/L的NH4HCO3(含6％乙腈)溶液抽提粗肽, 并冷冻干燥得765 mg, 产率为73.6％。

1.2.4       人胰岛素原C肽和人胰岛素原C肽K的免疫活性测定          用Immulite免疫分析方法测定(使用美国DPC公司免疫试剂盒)。 测试杯中有一个特异性抗体包被珠, 样品和碱性磷酸酶偶联的多抗自动加入测试杯, 在37 ℃进行振荡温育1 h。 温育结束后, 测试杯垂直高速旋转, 反应液被彻底甩入外腔。 几次清洗后, 游离标记物被彻底地分离出去,
再加入发光底物, 高灵敏光电倍增管读取发光记数。

2    结果(Results)

2.1   人胰岛素原C肽的纯化与鉴定

取HF酸解后抽提得到的人胰岛素原C肽粗品240 mg溶于0.025 mol/L的NH4HCO3溶液, 经Sepadex G-15柱层析去盐, 在230 nm紫外波长监测下收集主峰冷冻干燥后得92 mg, 取其中50 mg以TSK HW-40(F)柱纯化(图1)收集主峰, 冻干得35 mg, 纯化回收率为26.8％, 以HPLC鉴定纯度达95%(图2)。

合成的人胰岛素原C肽经质谱鉴定(电喷雾离子肼, ESI), 其分子量为3019.539, 与理论分子量3020.29相符。 氨基酸组成分析符合理论值(表 1)。蛋白质N端全序列分析符合理论排列, 分子精确完整(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGS-LQ)。

Table 1   Human proinsulin C-peptide amino
acid assay

Sample were
hydrolyzed in 6 mol/L HCl.

2.2   人胰岛素原C肽K的纯化与鉴定

取HF酸解后抽提所得人胰岛素原C肽K粗品765 mg, 先经Sepadex G-15柱去盐, 冻干得536.2 mg, 取254 mg以TSK HW-40(F)柱纯化(图 3)收集主峰, 冻干得160 mg, 取9 mg再以HPLC纯化得纯品4.4 mg, 纯化回收率为21％, 经HPLC鉴定纯度达99％(图 4)。

人胰岛素原C肽K纯品经质谱鉴定其分子量为3148, 与理论分子量3148.47相符。 氨基酸组成分析符合理论值(表 2)。

Table 2   Human
proinsulin C-peptide K amino acid assay

Sample were
hydrolyzed in 6 mol/L HCl.

结果发现, 5个C端序列分析的结果符合理论排列(GSLQK), N端全序列分析也符合理论排列(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQK)。

2.3   人胰岛素原C肽和人胰岛素原C肽K在Hitrp Q-HP阴离子交换柱上的鉴定

结果显示人胰岛素原C肽和人胰岛素原C肽K由于等电点不同, 在Hitrp Q-HP柱上表现不同的保留时间(图5)。

Fig.5       Identification
of human proinsulin C-peptide and human proinsulin C-peptide K on FPLC

Column, Hitrp Q-HP 1 mL; buffer A, 0.05
mol/L Tris-HCl (pH 8.0); buffer B, 0.05 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) + 1 mol/L NaCl.
Gradient of buffer B: 0%–10% B, 0 column volume; 10% B, 10 column volume; 10%－15% B, 0 column
volume; 15% B, 10 column volume.

2.4   人胰岛素原C肽和人胰岛素原C肽K的免疫活力测定

用美国DPC公司的Immulite进行C肽和C肽K的免疫活性分析, 表明两者都有免疫活性。

3    讨论(Discussion)

近年来发现游离人胰岛素原C肽联合胰岛素可以改善I型糖尿病患者的血管神经病变, 其作用机制可能是通过与人细胞膜上G蛋白偶联受体结合[8]; 尤其是高鑫等[4,5]发现C肽可以减少糖尿病鼠肾小球细胞外基质积聚导致系膜扩张, 因此制备高纯度C肽药物(无论是合成或是基因工程方法)已成为迫切需要。

我们以前曾用谷氨酰胺的α羧基与PAM树脂偶联的固相法合成人胰岛素原C肽的粗产物, 从中分离得到分子量比人胰岛素原C肽低18道尔顿的人胰岛素原C肽副产物。 这可能是C端第一个谷氨酰胺与树脂偶联时侧链酰胺发生了脱水副反应形成的氰化物[9]。 为了防止此副反应, 可将C端第一个谷氨酰胺残基的侧链酰胺用Trt保护, 再偶联上PAM树脂, 但是价格昂贵。 我们改用BOC-Gluγ-COOH-Obzl(叔丁氧羰酰γ–羧基、α-卞酯谷氨酸)与MBHA树脂上的氨基缩合作为C端启始物, 再逐个延伸肽链缩合完成后经HF切割后得到C端谷氨酰胺的人胰岛素原C肽产物。 由于MBHA的氨基与γ–羧基形成稳定的酰胺键, 不仅防止了缩合时产生的脱水氰基化合物, 也可避免谷氨酰胺环化形成焦谷氨酸。 由于MBHA树脂价格低于PAM树脂, 这样既稳定又降低成本, 合成产率略有提高, 是化学合成人胰岛素原C肽途径的又一选择; 因为当Asn或Gln为C端第一个氨基酸残基上固相树脂时易发生副反应, 而改用Asp或Glu侧链上MBHA树脂是另一种可选的合成途径。

基因工程高表达小分子多肽仍存在一定困难, 如人胰岛素原C肽K作为单元件, 多拷贝表达是可选择方法之一,
产物经酶切可得到人胰岛素原C肽。 据报道人胰岛素原C肽K是人胰岛素原加工中间产物, 也具有活性[1]。 本实验也证明人胰岛素原C肽K具有免疫活性。

我们在H-Q层析分析中显示人胰岛素原C肽和人胰岛素原C肽K的不同保留时间, 可为基因工程表达后药物的酶切后加工产物的纯化和鉴定提供实验依据。

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邵晓霞同志为本研究作质谱分析,特此致谢。

References

1     Ido
Y, Vindigni A, Chang K, Stramm L, Chance R, Heath WF, DiMarchi RD et al.
Prevention of vascular and neural dysfunction in diabetic rats by C-peptide．Science, 1997, 277: 563－566

2     Johansson
BL, Borg K, Ferngvist-Forbes E, Kemell A, Odergen T, Wahren J．Beneficial effects of C peptide on
incipient nephropathy and neuropathy in patients with type 1 diabetes mellitus.
Diabet Med, 2000, 17(3): 181－189

3    Wahren
J, Johansson BL. Ernst-Friedrich-Pfeiffer memorial lecture new aspects of
C-peptide physiology. Horm Metab Res, 1998, 30: A2－A5

4     Sun
W, Gao X, Cui DF, Xia QC.
Prevention of diabetic nephropathy in 12 week STZ induced diabetic rats treated
by C-peptide. Fudan Univ J Med Sci, 2002, 29(5): 338－342

5     Chin
J Endocrinal Metab, 2002, 18(4): 272－273

6     Li
MY, Liu ZH, Shao XX, Xia QC, Zhou GM, Lin QS, Cui DF. Synthesis of human
proinsulin C-peptide and preparation of specific antibody to it. Acta Biochim
Biophys Sin, 2000, 32(6): 665－668

7     Analytical
Bio-Chemistry, 1970, 34: 595－598

8     Rigler
R, Pramanik A, Jonasson P, Kratz G, Jansson OT, Nygren P, Stahi S et al． Specific binding of proinsulin
C-peptide to human cell membranes． Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96(23): 13318－13323

9     Huang
WD, Chen CQ. Peptide Synthesis. Beijing:
Science Publishing Company, 1985, 74

Updated at: 2003-10-09