Molecular Pathological
Characteristics of Human B-Cell Lymphomas Induced by Epstein-Barr Virus

GAN Run-Liang*,
YIN Zhi-Hua¹, LIU Teng-Fei¹, DONG Bi-Hua, ZHOU Jian-Guo,
YAO Kai-Tai¹

( Cancer Research Institute, Nanhua
University, Hengyang 421001, China; 1Cancer Research Institute, Xiangya Medical
School, Central South University, Changsha 410078, China )

Abstract        To identify
molecular features of neoplasms associated with EB virus, human peripheral
blood lymphocytes (huPBL) were isolated from healthy volunteer donors and were
transplanted intraperitoneally into SCID mice, and then huPBL/SCID mice were
infected with EB virus. Serum levels of human IgG were measured by
unidirectional immunodiffusion assay. Human Alu sequence and EBER-1 in tumor
tissues were detected with PCR and in situ hybridization. Immunohistochemical
staining was used to examine leukocyte differentiation antigens (LCA, L26,
UCHL1, PS1), viral gene products (LMP1, EBNA2, BZLF1) and cellular oncoproteins
(p53, C-myc, Bcl-2 and Bax). The experiments showed that tumors developed in 24
of 34 surviving huPBL/SCID mice by EBV infection. Histopathological and
immunohistochemical observations demonstrated that all of the induced tumors in
SCID mice were malignant lymphomas derived from human B-lymphocytes. In situ
hybridization showed that tumor cells had EBV-encoded small RNA-1 (i.e.
EBER-1). Alu sequence could be amplified by PCR from human genome of tumor
tissues. Immunohistochemistry detected positive staining of BZLF1-encoded
protein in a small population of tumor cells of almost all cases, and positive staining
of LMP1 and EBNA2 only in small number of tumor cells. Human IgG could be found
in the serum of 12 SCID mice on the 15th day after huPBL engraftment, and then
increased with time and with the development of induced tumors in 6 mice.
Positive rates of p53, C-myc, Bcl-2 and Bax expression were 83.33%, 100%,
95.83%, 91.67%, respectively, in 24 cases of the EBV-induced lymphomas. The
results indicate that molecular lesions associated with the induced B-cell
lymphoma involved EBV infection, expression of oncogenic viral genes, and
abnormal expression of cellular oncogenes in human xenografts. Human IgG level
in the serum of huPBL/SCID mice can be considered as a useful index for tumor
development.

Key
words     Epstein-Barr
virus; induced lymphoma; molecular characteristics; human IgG; oncogene;
huPBL/SCID mice

_________________________________________

Received: May
12, 2003        Accepted:
June 30, 2003

This work was supported by the grants from
the Key Projects of the National Natural Science Foundation of China (No.
39730200) and the Hunan Provincial Foundation for Young Scientists (No.
JY-0213040)

*Corresponding author: Tel, 86-734-8281510;
Fax, 86-734-8280907; e-mail, [email protected]

EB病毒诱发人B细胞淋巴瘤的分子病理特性

甘润良*    尹志华¹   刘腾飞¹   冬毕华     周建国     姚开泰¹

( 南华大学肿瘤研究所, 衡阳 421001； 1中南大学湘雅医学院肿瘤研究所, 长沙 410078 )

摘要       EB病毒（EBV, Epstein-Barr virus）与人类多种肿瘤有关, 尤其是与鼻咽癌和淋巴瘤的关系密切。 为此研究了EB病毒在huPBL/SCID嵌合体小鼠体内诱发人B细胞淋巴瘤的分子特性及肿瘤发生机制。 从健康成人外周血分离出淋巴细胞, 将之移植到SCID小鼠腹腔内, 实验感染EBV, 观察肿瘤的形成； 采用单向免疫扩散法连续监测小鼠血清中人IgG的含量。 分别用PCR方法检测肿瘤组织中是否存在人Alu序列, 原位杂交检测肿瘤组织中EB病毒小RNA 分子EBER-1； 免疫组织化学方法检测人白细胞分化抗原（CD45、 CD20、 CD45RO、 CD3）, 病毒基因（LMP1、 EBNA2、 BZLF1）的表达, 以及细胞瘤基因蛋白（p53、 C-myc、 Bcl-2、 Bax）在诱发肿瘤中的表达情况。
结果发现, 实验中34只感染EBV 的huPBL/SCID小鼠有24只诱发出肿瘤, 根据病理形态学特征、
Alu-PCR和免疫标志均证实诱发瘤是人源性B淋巴细胞肿瘤。 原位分子杂交显示肿瘤细胞核内存在EBER-1, 少数瘤细胞表达EB病毒BZLF1蛋白阳性, 部分瘤细胞表达LMP1和EBNA2蛋白阳性。 连续监测12只huPBL/SCID小鼠血清中人IgG含量, 发现IgG水平随诱瘤时间延长和肿瘤生长有逐渐增高趋势。 免疫组化显示诱发的24例淋巴瘤组织p53、 C-myc、 Bcl-2和Bax蛋白表达阳性率分别为83.33%、 100%、 95.83%、 91.67%。 结果提示, 诱发性淋巴瘤的分子病变包括EB病毒感染和致瘤基因表达、 并诱导宿主细胞瘤基因过表达；
监测huPBL/SCID小鼠血清中人IgG升高水平可作为该动物模型预测肿瘤发生的指标。

关键词   EB病毒； 诱发性淋巴瘤；
分子特性； 人IgG； 瘤基因； huPBL/SCID小鼠

Epstein-Barr 病毒（EBV）是一种γ疱疹病毒, 主要感染人淋巴细胞和口咽部上皮细胞。 临床研究表明, EBV与鼻咽癌、 淋巴瘤的关系密切[1,2]。 近年来, 随着人类器官移植手术的开展及艾滋病患者的增多, 免疫缺陷状态下发生的淋巴细胞异常增生症及其与EBV的关系日益受到重视[3,4],
EBV相关淋巴瘤已成为一组非常重要的临床疾病。 虽然在体外细胞培养条件下EB病毒可使人淋巴细胞和鳞状上皮细胞发生转化, 但要确证EBV是引起肿瘤的病因还应进行动物实验, 而目前还没有真正理想的研究EBV感染和致瘤性的实验动物模型。本实验在成功构建huPBL/SCID嵌合体小鼠后利用EB病毒诱发出恶性淋巴瘤的基础上[5], 进一步检测了诱发瘤的分子与细胞生物学特性。

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   材料

C.B.-17
SCID/SCID小鼠（鼠龄5～6周, 雌雄兼用）由北京中国科学院实验动物中心提供。 人淋巴细胞（PBL）从健康成人义务献血员抽取外周静脉血分离获得(血液由衡阳市中心血站提供)。 B95-8细胞是体外用EBV转化狨猴B淋巴细胞所建立的最广泛使用的标准细胞株, 可以释放具有转化能力的EBV颗粒。

1.2   方法

1.2.1       HuPBL/SCID嵌合体小鼠的构建        SCID小鼠严格饲养在恒温（20～26 ℃）、
恒湿（50%～65%）的空气洁净层流架内。 用淋巴细胞分离液从外周静脉血分离出正常成人淋巴细胞（PBL）, 用不含小牛血清的1640培养液将PBL浓度稀释到(8～10)×107个/mL。 无菌条件下分别给SCID小鼠腹腔接种人PBL悬液1 mL。

1.2.2       EB病毒分离与感染      经大规模培养B95-8细胞, 预备抽提EBV之前, 采取饥饿疗法将细胞放置7～10天, 收集培养液, 以4000 r/min 4 ℃离心30 min, 将上清液转移至另一无菌的离心管中, 12 000 r/min 4 ℃离心120～150 min, 弃上清液, 加入原培养液1%的新鲜培养基, 反复用吸管吹打, 3000 r/min离心20 min。 用0.22 μm一次性过滤器将上清液过滤得到浓缩100倍的EBV悬浮液, 分装后置－80 ℃保存。 实验感染前用无血清1640培养基稀释EBV浓缩液, 对接种EBV阴性感染者来源PBL的动物, 在接种人PBL后三天经腹腔注射EB病毒悬液0.4 mL。 对接受EBV阳性感染献血员PBL的小鼠, 不再进行实验感染。

1.2.3       小鼠血清中人IgG含量的检测    SCID小鼠移植人PBL后3天、 7天、 15天、 22天, 以后每隔10天在无菌条件下采尾静脉血一次,
分离血清置－80 ℃保存。 采用单向免疫扩散法, 取鼠抗人IgG免疫扩散板一块, 将待测血清用生理盐水1:5稀释后, 用定量加样器每孔加样10 μL, 放入37 ℃湿盒中培养24 h, 取出后测沉淀环直径, 根据厂商提供的IgG沉淀环直径和含量对照表, 计算出本实验检测样本中IgG的含量。

1.2.4       实验动物的解剖和病理学检查    SCID小鼠濒死前处死, 存活鼠PBL移植后135天时处死, 大体观察病变情况, 有肿块者取部分肿块于－80 ℃冻存, 其余部分与各实质脏器一起常规取材, 10％中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 作4 μm厚的连续切片, 常规HE染色, 光学显微镜下确诊病变。

1.2.5       免疫组织化学染色       采用链霉素抗生物素蛋白–过氧化酶（S-P）免疫组化方法检查。 （1） 组织分化抗原: 人类白细胞共同抗原CD45（LCA）、 B细胞标记CD20（L26）、 T细胞标记CD45RO（UCHL-1）和CD3（PS1）。 （2） EB病毒表达产物: 潜伏膜蛋白LMP1、 核抗原EBNA-2和BZLF-1。 （3） 细胞瘤基因相关蛋白质: 突变型p53、 C-myc、 Bcl-2和Bax。

1.2.6       组织DNA的提取和PCR扩增    以酚–氯仿法提取肿瘤组织DNA, 应用PCR方法扩增221 bp的人特异性Alu序列。 人Alu序列引物[6]为: 5′-CAC CTG TAA TCC CAG CAG TTT-3′、 5′-CGC GAT CTC
GGC TCA CTG CA-3′, 循环条件为95 ℃变性5 min、 94 ℃ 1 min、 57 ℃ 1 min、 72 ℃ 1 min, 共30个循环, 72 ℃延伸5 min。 从PCR产物中取5 μL经1.5%的琼脂糖凝胶电泳20～30 min后于紫外仪上观察, 若在221 bp处出现与阳性对照一致的橙黄色条带, 则为人Alu序列阳性。

1.2.7       原位分子杂交检测EBER-1         参照文献[7]设计EBER-1寡核苷酸探针序列5′-CTC CTC CCT AGC AAA ACC CTC AGG
ACG GCG-3′。 地高辛标记探针, 石蜡切片经脱蜡水化后, 蛋白酶K 37 ℃消化10 min, 再滴加杂交液（25%去离子甲酰胺、 4×SSC、 50 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、 1 mmol/L EDTA、 5×Denhardt’s溶液、 1 g/L ssDNA、 100 μg/L探针）, 70 ℃变性8 min后, 37 ℃杂交4 h或过夜, 以杂交液中无标记探针为阴性对照, 最后进行信号显示。

2    结果(Results)

2.1   肿瘤的发生与鉴定

本实验34只SCID小鼠移植人PBL并感染EB病毒, 有24只小鼠在其腹腔和/或纵隔形成肿瘤[5], 成瘤率为70.6%（24只/34只）。 带瘤小鼠存活天数最短为31天, 最长为137天, 中位存活时间为60天。 肿瘤为实体瘤, 肿块有的呈球形结节状, 界限清楚, 无包膜, 有的呈不规则结节状, 与周围脏器多有粘连, 肿瘤直径0.2 cm～3.6 cm大小, 灰白或灰红色。
显微镜下观察肿瘤细胞弥漫排列, 体积较大, 形态多样, 呈现大裂–无裂混合细胞, 浆细胞样淋巴细胞和免疫母细胞样形态, 核分裂常见, 可见瘤巨细胞。 胞质丰富淡红染, 核膜厚, 染色质呈粗颗粒状, 可见1～3个大小不等的核仁。 肿瘤可侵犯小鼠邻近器官, 发生在腹腔的肿瘤常累及肝、 肾、 胰、 肠系膜和腹后壁肌肉[图1（A）], 发生在纵隔的肿瘤可侵袭肺、 心包膜和胸后壁肌肉。 免疫组化检测白细胞共同抗原（LCA）阳性, T细胞标记（CD3和CD45RO）阴性, B细胞标记（CD20）阳性[图1（B）]； 经PCR方法检测肿瘤组织中人Alu序列, 所有肿瘤组织均有221 bp的人Alu序列特异性扩增条带（图2）, 从而诊断肿瘤系人B细胞性淋巴瘤。

2.2   肿瘤细胞中EB病毒基因及蛋白质表达

原位分子杂交检测所有肿瘤细胞EB病毒编码小RNA分子（EBER-1）表达为阳性[图3(A)], 信号定位于胞核中, 为紫蓝色, 而荷瘤小鼠组织及肿瘤邻近的宿主脏器细胞均为阴性。
应用免疫组化显示, 约10%瘤细胞表达EB病毒BZLF1基因编码ZEBRA蛋白, 定位于胞核[图3(B)]； 部分肿瘤细胞表达潜伏膜蛋白LMP1和EB病毒核抗原EBNA2为阳性。

Fig.3       Expression
of EBV genome in the EBV-induced lymphoma of SCID mice

(A) Positive signals of EBER-1 were located in the nuclei of all tumor
cells by in situ hybridization(×400). (B) Immunohistochemical staining of BZLF1-encoded protein was
positive in a small population of tumor cells and located in the nuclei of
tumor cells(SP×400).

2.3   小鼠血清中人IgG含量的检测及其意义

本实验共有12只SCID小鼠进行了血清中人IgG的测定, 结果发现6只出现明显肿块（直径大于0.5
cm）的小鼠自移植人PBL后15天起血清中即可检测出人IgG, 且人IgG含量随实验进行时间的延长而增高, 濒死前达到高水平。 表1提示嵌合体小鼠血清中人IgG含量不仅与移植淋巴细胞来源的献血员本身体内IgG水平有关, 也与诱发肿瘤时间及肿瘤生长呈正相关, 但与不同小鼠处死时见到的肿块大小差异之间无明显关系。 此外, 本实验中有3只小鼠肉眼未见明显肿块, 只在镜下发现肺内有微小淋巴增生病灶； 还有另外3只肉眼和镜下均未见肿瘤病变。该6只小鼠在实验过程中一直未检测到血清中人IgG的存在。

Table 1   The
concentrations of human IgG in serum of SCID mice at different time points
after PBL transplantation

^a The volume of
tumor was reckoned according to (longest diameter × shortest
diameter)/2, and then tumor volume in chest plus that in abdominal cavity was
the overall volume of induced tumor in each mouse.

2.4   细胞瘤基因表达的P53、 Bcl-2、 Bax、 C-myc蛋白

肿瘤组织中p53、 Bcl-2、 Bax、 C-myc蛋白表达阳性率分别为83.3%（20/24）、 95.83%（23/24）、 91.67%（22/24）、 100%（24/24）, 其中Bcl-2和Bax共表达87.5%（21/24）（表2）。 免疫组化染色显示瘤细胞p53蛋白阳性定位于胞核,
Bcl-2蛋白阳性位于胞质和核膜,
Bax蛋白阳性定位于胞质,
C-myc蛋白阳性位于胞核。

Table 2   Expression
of p53, Bcl-2, Bax, C-myc proteins in the EBV-induced lymphomas

3    讨论(Discussion)

建立EBV感染和诱发淋巴瘤模型, 对于进一步探索EBV的致瘤机制和防治研究是十分必要的,也可为研究EBV与人类鼻咽癌等其他恶性肿瘤的确切关系及其癌变机制提供重要线索。 本实验在接受健康成人外周血淋巴细胞移植的SCID小鼠体内, 观察到EB病毒诱发的实体性淋巴细胞肿瘤形成, 肿瘤诱发率为70.6%（24只/34只）, 它具有侵袭性和致死性。 显微镜下观察, 肿瘤细胞为大裂–无裂细胞, 有的呈免疫母细胞样形态, 有的具有明显的浆细胞分化特征。 组织病理学观察结果显示为高度恶性的非何杰金氏淋巴瘤, 同时应用免疫组化和Alu-PCR进一步证实肿瘤是人B细胞性淋巴瘤。

IgG是成熟B细胞受抗原刺激分化为浆细胞后产生的免疫球蛋白, 文献报道通过检测小鼠血清中人IgG可预测移植人PBL的SCID小鼠的免疫重建成功与否[8,9]。 本实验对移植人PBL的SCID小鼠血清中人IgG水平的连续监测结果提示, SCID小鼠血清中人IgG水平的升高与EBV诱发肿瘤的发生和发展有明显的正相关关系, 凡是可检测出IgG含量且随时间推移有逐渐增高趋势的诱瘤小鼠最终在其体腔内发现肿瘤, 而检测不出IgG的SCID小鼠可能只有在显微镜下才可发现的微小淋巴增生病灶, 或者最终也无肿瘤发生。 这一检测方法和结果对于今后复制淋巴瘤动物模型有很重要的实际意义, 提示我们可以通过对实验小鼠血清中人IgG含量的检测来预测肿瘤的发生, 并为我们以后对EBV诱发肿瘤进行实验性治疗提供了一个可靠的血清学标志。

本组诱发瘤p53、 C-myc、 Bcl-2、 Bax蛋白表达阳性率分别为83.3%（20/24例）、 100%（24/24例）、 95.83%（23/24例）、 91.67%（22/24例）, 提示淋巴瘤的发生可能与突变型p53蛋白的过多积累功能失活、 C-myc激活、 Bcl-2表达上调有关。 Ehsan等[10]对10例传染性单核细胞增多症患者的淋巴结活检组织检测发现均有p53蛋白表达, 且EBER1-ISH亦阳性, 而11例对照淋巴组织无一例p53阳性或EBER1阳性, 进一步分析发现LMP1与p53共表达于同一阳性细胞中, 提示EBV感染与p53过表达相关。 实验证实EBV的潜伏膜蛋白LMP1可以上调Bcl-2蛋白的表达[11], 而且Bcl-2蛋白水平的上升比bcl-2 mRNA表达出现得早, 提示LMP1参与bcl-2的转录及转译机制, 表明EBV可通过调控Bcl-2的表达而抑制细胞凋亡, 导致肿瘤发生。

EBV是一种嗜人类B淋巴细胞的疱疹病毒, 在单一EBV感染而无其他处理因素存在下, 可在免疫缺陷动物（huPBL/SCID嵌合体小鼠）体内诱发人源正常B淋巴细胞形成肿瘤； 动物实验结果证明, EBV具有肿瘤病毒的特性, 提示EBV对人类细胞具有较强的致瘤性[5]。 检测EB病毒感染最敏感和高特异的方法是原位杂交检测EBV-EBERs[7,12], 我们的检测结果也表明所有肿瘤细胞核中均有较强的杂交信号, 阳性率为100%。 EBERs是EB 病毒潜伏感染细胞内最丰富的转录产物, 然而直到现在人们才发现EBERs对于维持Burkitt淋巴瘤细胞的恶性表型起关键作用, EBERs可赋予其在软琼脂培养中克隆生长的能力、 裸鼠成瘤性和凋亡抗性等[13]。 免疫组化发现BZLF1在本实验诱发瘤中约10%的肿瘤细胞里可见阳性表达, 体外实验[14]表明BZLF1基因产物在EB病毒基因从潜伏期活化进入增殖周期和产病毒状态的调节控制中起核心作用。

EBV通过其受体CR2感染人类B淋巴细胞后[15], 在体内免疫监视受抑或缺陷的条件下, EBV基因表达产物直接作用于宿主细胞, 或通过干扰宿主细胞的信号转导系统, 诱导细胞发生恶性转化。 受感染细胞分裂增殖, 病毒和宿主细胞基因异常表达, 最终发展为恶性克隆, 形成肿瘤。 本研究发现, 诱发瘤的分子病变包括EB病毒感染和致瘤基因表达、 以及宿主细胞瘤基因过表达；
监测huPBL/SCID小鼠血清中人IgG的升高水平可作为该动物模型预测肿瘤发生的指标。

References

1     Raab-Traub
N. Epstein-Barr virus in the pathogenesis of NPC. Semin Cancer Biol, 2002,
12(6): 431－441

2     Pagano
JS. Viruses and lymphomas. N Engl J Med, 2002, 347(2): 78－79

3     Haque
T, Crawford DH. The role of adoptive immunotherapy in the prevention and
treatment of lymphoproliferative disease following transplantation. Br J Heamatol,
1999, 106(2): 309－316

4     Oertel
SH, Riess H. Immunosurveillance, immunodeficiency and lymphoproliferations.
Recent Results Cancer Res, 2002, 159: 1－8

5     Yin
ZH, Liu TF, Tang YL, Wang LJ, Gan RL. Effect of cyclosporin A on stable
established lymphoma models induced by Epstein-Baarr virus. Chinese Journal of
Immunology, 2002, 18(11): 760－763

6     Fukuchi
Y, Miyakawa Y, Kizaki M, Umezawa A, Shimamura K, Kobayashi K, Kuramochi T et
al. Human acute myeloblastic leukemia-ascites model using the human GM-CSF- and
IL-2-releasing transgenic SCID mice. Ann Hematol, 1999, 78(5): 223－231

7     Khan
G, Coates PJ, Kangro HO, Slavin G. Epstein-Barr virus(EBV) encoded small RNAs:
Targets for detection by in situ hybridization with oligonucleotide probes. J
Clin Pathol, 1992, 45(7): 616－620

8     Duchosal
MA, Mauray S, Ruegg M, Trouillet P, Vallet V, Aarden L, Tissot JD et al. Human
peripheral blood leukocyte engraftment into SCID mice: Critical role of CD4+ T
cells. Cell Immunol, 2001, 211(1): 8－20

9     Taylor
MD, Else KJ. Human trichuris-specific antibody responses in vaccinated
hu-PBL-SCID mice. Parasite Immunol, 2002, 24(1): 1－13

10    Ehsan
A, Fan H, Eagan PA, Siddiqui HA, Gulley ML. Accumulation of p53 in infectious
mononucleosis tissues. Hum Pathol, 2000, 31(11): 1397－1403

11    D. Souza
B, Rowe M, Walls D. The bfl-1 gene is transcriptionally upregulated by the
Epstein-Barr virus LMP1, and its expression promotes the survival of a Burkitt’s lymphoma cell line. J Virol, 2000,
74(14): 6652－6658

12    Gulley
ML, Glaser SL, Craig FE, Borowitz M, Mann RB, Shema SJ, Ambinder RF. Guidelines
for interpreting EBER in situ hybridization and LMP1 immunohistochemical tests
for detecting Epstein-Barr virus in Hodgkin lymphoma. Am J Clin Pathol, 2002,
117(2): 259－267

13    Nanbo
A, Takada K. The role of Epstein-Barr virus-encoded small RNAs (EBERs) in
oncogenesis. Rev Med Virol, 2002, 12(5): 321－326

14    Kraus
RJ, Mirocha SJ, Stephany HM, Puchalski JR, Mertz JE. Identification of a novel
element involved in regulation of the lytic switch BZLF1 gene promoter of
Epstein-Barr virus. J Virol, 2001, 75(2): 867－877

15    Bouillie
S, Barel M, Frade R. Signaling through the EBV/C3d receptor (CR2, CD21 ) in
human B lymphocytes: Activation of phosphatidylinositol 3-kinase via a
CD19-independent pathway. J Immunol, 1999, 162(1): 136－143

Updated at: 2003-10-09