Sequence and Functional Analysis of the
Chromosome Replication Origin (oriC) of Streptoverticillum caespitosus
ATCC27422

MA Wei, MAO Xiang, LU Jie, JIANG Wei-Hong, QIN Zhong-Jun, ZHAO Guo-Ping*

( Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai
Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200032, China
)

Abstract        Twenty-two
DnaA boxes were identified in the chromosome replication origin (oriC) of
Streptoverticillum caespitosus ATCC27422 based upon the characteristics of
consensus sequences. The 21st and 22nd DnaA boxes overlapped 8 base pairs each
other reversely. Compared with the oriC database of actinomycetes, similar
overlapping DnaA boxes were recognized in several species of Streptomyces and
Mycobacterium. These overlapping DnaA boxes were composed of the last two DnaA
box (21st and 22nd) in the Streptomyces species, but the of 1st and 2nd ones in
the Mycobacterium species. The consensus sequence of the overlapping DnaA box
is CTGTGCACAA, one base longer than the normal DnaA box sequence presumably due
to the overlapping structure. Although the DnaA boxes exist in the 189－792 bp region only, the 1－188 bp and 793－939 bp regions are also important
to the DNA replication. Deletion of the 1－188 bp region may cause absolute loss of DNA replication initiation
activity measured by the transformation efficiency of plasmids with truncated
oriC. When the 793－939 bp region was truncated, the transformation efficiency reduced
about 40%. If the oriC was cloned into a vector with partial flanking region
sequences (partial dnaAand dnaN gene sequences), the transformation rate was
about 4.3-fold lower than that of the construct containing the oriC region
only. However, the transformants were much more similar to the host with
respect to the morphology of colony and mycelium. The cis-regulatory functions
of the flanking sequences, which may influence the initiation efficiency of the
chromosome replication and/or the stability of replicon, are thus suggested.

Key
words     Streptoverticillum
caespitosus; replication origin (oriC); overlapping DnaA box

____________________________________________

Received; May
2, 2003         Accepted:
July 14, 2003

This work was supported by a grant from Key
Program of National Natural Science Foundation of China (No. 10039630010)

*Corresponding author: Tel, 86-21-64728788;
Fax, 86-21-64042385; e-mail, [email protected] or [email protected]

头状链轮丝菌(Streptoverticillum
caespitosus)ATCC27422染色体复制起始区(oriC)的序列分析与功能研究

马伟    茅翔    卢捷    姜卫红     覃重军     赵国屏*

( 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所， 上海200032 )

摘要       头状链轮丝菌(Streptoverticillum caespitosus)ATCC27422染色体复制起始区(oriC)内共有22个DnaA盒结构； 其中第21、 22个DnaA盒彼此方向相反、
相互重叠8个碱基。
放线菌oriC数据库搜索发现， 这种重叠DnaA盒在抗生素链霉菌、 结核分枝杆菌等几种放线菌中也同样存在。 在分枝杆菌中一般由第1、 2个DnaA盒组成，
而在链霉菌中由最后的两个DnaA盒(第21、 22)组成。 重叠DnaA盒保守序列为CTGTGCACAA， 长度为10个碱基， 即由于重叠的缘故比正常DnaA盒长1个碱基。 通过测量载体对变铅青链霉菌的转化效率研究了oriC不同部位在染色体复制起始中的功能和地位。 头状链轮丝菌oriC序列的5′端1～188位的片段虽然不包含有DnaA盒结构， 但该片段的缺失， 造成oriC复制起始功能的完全丧失。
3′端793～939位片段同样没有DnaA盒结构， 该片段的缺失， 仅发生转化效率的降低约40％， 说明oriC的793～939位序列对DNA复制起始效率以及复制子稳定性起重要作用。 当oriC被克隆入载体时两端各带有一段dnaA、 dnaN基因的部分序列， 所构建的载体虽然转化效率较低，
但转化子的菌落、 菌丝形态与宿主菌原有的表型相接近，
由此推断oriC两端的序列除了编码各自产物外， 可能通过影响染色体DNA复制的起始效率、 复制子稳定性等对染色体的复制起始发挥顺式调控作用。

关键词   头状链轮丝菌; 染色体复制起始区(oriC);
重叠DnaA盒

染色体DNA复制起始的分子机理以在E.
coli中的研究最为深入， 已基本弄清楚了复制的过程， 并构建了较为完善的复制起始分子模型[1]。 然而，
自然界中还存在着以链霉菌为代表的一大类革兰氏阳性真细菌， 这类细菌染色体DNA的(G＋C)%含量较高，
具有复杂的生活史, 能产生结构复杂、 具有多种生理活性的次生代谢产物，
而且该类微生物中有不少种类的染色体为线性构型。 这类微生物中复制起始区的研究起步较晚，
且主要局限于链霉菌[2]和分枝杆菌[3]。 研究发现， 两类微生物的复制起始区(oriC)的结构有较大的差别。 链霉菌和分枝杆菌的oriC比E. coli的不仅长度长， 结构也复杂得多， DnaA盒的保守序列也不同。 对这一大类微生物oriC的研究， 不仅能够丰富和完善人类对染色体DNA复制起始的认识， 而且可能帮助人们解开DNA复制过程中分子调控机理之迷， 因而具有重要的理论价值。
同时， 由于链霉菌、 分枝杆菌等与人类的经济活动、 健康事业等关系密切，
对其染色体DNA复制分子机理的研究将有助于人类更有效地控制或利用这些微生物。

头状链轮丝菌(Streptoverticillum caespitosus)ATCC27422是肿瘤治疗药物丝裂霉素A的产生菌， 本工作主要围绕该菌已克隆的oriC[4]进行功能结构的分析与研究。

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   材料

1.1.1       酶和试剂       限制性内切酶、 T4DNA连接酶、 碱性磷酸酶、 Taq酶等为TaKaRa公司产品。 其他生化试剂购自上海生工生物技术公司。

1.1.2       菌株与培养基       菌株与质粒见表1。

E. coli以固体或液体LB培养基于37℃培养，
E. coli转化子培养时， 培养基中加相应的抗生素， 浓度为: 100 mg/L氨苄青霉素。 变铅青链霉菌和头状链轮丝菌固体培养基为R2YE， 液体培养基为YEME， 转化子在培养基中加硫链丝菌素，
固体R2YE中终浓度为50 mg/L, YEME液体培养基中的终浓度为5 mg/L[7]， 培养温度为28 ℃。

Table 1   Strains
and plasmids

1.2   方法

1.2.1       变铅青链霉菌和E. coli DH5α的转化        变铅青链霉菌采用原生质体转化， 方法参照文献[7]。 E. coli DH5α采用电转化， 电转化感受态细胞制备以及电转化参照文献[8]。

1.2.2       DNA操作      头状链轮丝菌和变铅青链霉菌总DNA的提取参照文献[7], DNA的体外操作， 如质粒提取、 酶切、 连接、 电泳、 杂交等参照文献[9]及产品使用说明。

1.2.3       DNA序列测定与分析   PCR引物合成和DNA序列测定由基康生物技术公司进行。 引物设计使用引物软件进行(Primer, Primer Designer
Ver. 2.0, Copy Right 1990-1991, Scientific & Educational Software, 1990)， 亚克隆所使用的PCR引物见表2。PCR条件为: 94 ℃ 3 min， 94 ℃ 1 min， 58～62 ℃复性1 min， 72 ℃延伸1 min， 共30个循环。 序列分析采用Biosino的基于网络的序列分析软件SwqWeb (http://gcg.biosino.org)以及BioEdit(Tom Hall, Sequence Alignment Editor 1997. Department of
Microbiology, North Carolina State University, USA. Copy right 1997－2001)等序列分析软件进行。

Table 2   Primer
for sub-cloning of oriC of S. caespitosus

HindIII recognition site is underlined.

2    结果(Results)

2.1   头状链轮丝菌oriC片段中DnaA盒的结构分析

2.1.1       头状链轮丝菌oriC序列中DnaA盒的数量        高GC含量革兰氏阳性菌DnaA盒保守序列为TTGTCCACA[10]， 采用SeqWeb中Findpattern模块对头状链轮丝菌oriC序列进行分析， 寻找与DnaA盒保守序列差异少于或等于2个碱基的序列， 共发现22个DnaA盒， 结果见图1。 对已发表的放线菌oriC序列重新分析发现， 链霉菌oriC中DnaA盒的数量在22个左右， 分枝杆菌的oriC中存在5个DnaA盒。
结果见表3。

Fig.1       Position
and orientation of DnaA-boxes in the oriC of S. caespitosus

DnaA box in red is different with conserved sequence no more than one
nt， DnaA box in blue,
the difference is two nt; the arrows indicate the directions of the DnaA box;
the sequences in underline are the AT-rich fragment.

Table 3   Comparison
of oriC and DnaA-box of S. caespitosus with several Streptomycetes and Mycobacteria
species

The number in the parentheses
is from the reference.

2.1.2       头状链轮丝菌的DnaA盒各碱基保守性     对所有的DnaA盒根据其方向、 保守程度等进行分类统计分析(表4) 。 正向(与oriC方向一致)与反向(与oriC方向相反)、
较保守的(与保守序列相差一个碱基)和较不保守的DnaA盒 (与保守序列相差两个碱基)的碱基保守规律存在明显的差异。

Table 4   Conservation
of each nt in the DnaA-box of S. caespitosus

1, one nt difference with the
conserved DnaA box sequence; 2, two nt difference with the conserved DnaA box
sequence; Avr., overall situation of relevant kind of DnaA-box.

对于正向的较保守的DnaA盒， 近40％的变化发生在第一位的T上， 而同方向较不保守的DnaA盒有70％的变化平均地分布在第一、 第三和第九位上; 对于反向的DnaA盒， 较保守的DnaA盒只有两个， 变化分别发生在第五和第九位上，
而同方向较不保守的DnaA盒有近70％的变化平均发生在第二、
第三和第四位碱基上。

对于全部头状链轮丝菌的DnaA盒而言， 第六位的C最保守， 在22个DnaA盒中没有一个在第六位发生变化， 第八位的C也只发生了一次变化； 第四位T、
第五位的G、
第七位的A变化的概率小于10％， 最不保守的是第一位的T和第三位的G， 发生变化的概率达到20.6％。 而对于较保守的DnaA盒而言， 第四、
第六、 第七和第八位的碱基全部保守，
第二、 三位次之， 第五、 九位再次之， 第一位最不保守。

2.1.3       重叠DnaA盒及其普遍性     在头状链轮丝菌的oriC中， 第21个和第22个DnaA盒方向相反、
彼此有8个碱基相互重叠，
这种现象尚未见文献报道过。 对已发表的链霉菌、 分枝杆菌的oriC序列重新进行分析， 发现该现象并非头状链轮丝菌所独有(图2)。分别来自分枝杆菌、
链霉菌和链轮丝菌的5个重叠DnaA盒序列具有以下共同特征: (1)重叠DnaA盒序列均为CTGTGCACAA； (2)两个DnaA盒相互有8个碱基重叠； (3)重叠的DnaA盒位于DnaA盒区域的两端， 在分枝杆菌中由第一、 第二DnaA盒组成，
在抗生素链霉菌、 除虫链霉菌和头状链轮丝菌则由最后两个DnaA盒组成； (4)在重叠DnaA盒附近有富含AT的片段存在。 根据以上特点推测， 重叠DnaA盒在染色体DNA复制起始中很可能是一个重要的功能结构。

Fig.2       Overlapping
DnaA-box in several Actinomycetes oriC

 

2.1.4       头状链轮丝菌oriC中富含AT的片段oriC中富含AT的片段(AT rich fragment)是DNA复制时，
解链最早发生的位置。 在头状链轮丝菌oriC中共发现两段富含AT的片段， 它们是位于559～564的TAAAA和681～686的AAAAT。
其中位于681～686位的富含AT的片段紧接在一个DnaA盒的5′端。

2.2   头状链轮丝菌oriC的功能研究

2.2.1       头状链轮丝菌oriC的亚克隆策略根据头状链轮丝菌oriC的结构(图3)， 设计了四条引物(引物序列见表2)， 分别用于亚克隆939 bp的oriC、 缺失1～188 bp片段或缺失793～939 bp片段， 以及同时缺失这两部分片段的部分oriC。 详见表5。

2.2.2       头状链轮丝菌oriC中各片段在DNA复制起始中的作用分析        将头状链轮丝菌oriC的各个亚克隆片段分别插入到带有硫链丝菌素抗性基因且只能在E. coli中复制的pQC156质粒中， 各载体对变铅青链霉菌的转化效率，
反映了oriC不同部位在DNA复制起始中作用和地位[13]。

(1) 亚克隆片段构建的载体转化ZX7的转化效率将所构建的每种质粒分别转化S. lividans ZX7原生质体， 并计算转化效率， 每次实验样本数为5， 并重复三次,实验结果为三次实验的平均值。 具体实验条件如下: 新鲜制备的S. lividans ZX7原生质体浓度为109个/mL, 每50 μL原生质体加4 μL浓度为50 mg/L质粒DNA。 转化效率见图4。

图4中的实验结果表明， 头状链轮丝菌的oriC在变铅青链霉菌中可以被识别和启动。 pMJ23质粒包含完整的头状链轮丝菌的oriC， 以pMJ23转化ZX7转化效率为2.9×103个/μg DNA， 在所有质粒中其转化效率最高。
当oriC中第22个DnaA盒到dnaN之间的一段146 bp的序列被缺失后(即pMJ22)， oriC仍具有起始功能，
但转化效率下降了41.4%。 当oriC的5′端第一个DnaA盒之前的188 bp序列被缺失后， 其构建的载体(pMJ24和pMJ25) 完全丧失了对变铅青链霉菌的转化能力， 即 oriC的功能完全丧失。 另一个值得关注的现象是， 当oriC两端分别带上部分dnaA(27
bp,)、 部分dnaN(351 bp)基因序列时(pMJ9)， 转化效率急剧下降， pMJ9的转化效率为pMJ22的23％，
是pMJ23的12.5%。

Fig.4       Transformation
rate of S. lividans ZX7 by different constructs

(2) ZX7转化子菌落形态观察     对每种质粒转化子的菌落形态进行了观察(图5)， pMJ22、 pMJ23质粒的转化子菌落扁平、 边缘形状不规则(B、C)； 而pMJ9转化子的菌落呈饱满的圆形(A),与宿主菌原来的菌落形态相似。

 

Fig.5       Colony
morphology of S. lividans ZX7 transformants

(A)
pMJ9 transformants. (B) pMJ22 transformants. (C) pMJ23 transformants.

(A) Normal myceliun of ZX7. (B) ZX7
transformant of pMJ 9. (C) ZX7 transformant of pMJ 22. (D) ZX7 transformant of
pMJ 23.(3) ZX7转化子菌丝显微镜观察采用盖玻片插片法使菌丝生长在盖玻片上， 然后按文献[17]的方法进行原核染色， 结果见图6。 显微观察发现， ZX7(A部分)与pMJ9转化子(B部分)的菌丝较长， 分枝较多， 菌丝粗壮， 原核明显。 而pMJ22、 pMJ23的转化子菌丝较短， 分枝少， 菌丝细弱、 稀疏， 原核较小(C、D部分)。

Fig.6       Mycelium
morphology of S. lividans ZX7 and relevant transformants

3    讨论(Discussion)

文献报道链霉菌oriC中一般含有DnaA盒19个左右[10,13,18]。 头状链轮丝菌oriC中包含有22个DnaA盒结构， 是目前文献报道中最多的；
且第21、 22个DnaA盒相互重叠， 这种现象尚未见报道。 根据重叠DnaA盒结构在几种链霉菌、 分枝杆菌的oriC序列中同样存在这一现象， 以及重叠DnaA盒位置、 序列的高度保守等特征推断重叠Dna-盒可能是DNA复制起始过程中重要的功能结构。

Schaper等[19]在研究E. coli染色体复制起始时发现， DnaA蛋白与oriC中的各个DnaA盒的结合是存在一定的先后顺序的, 而且这种先后顺序与DnaA盒的序列有关。

Jakimowicz等[11]研究了S. lividans的DnaA蛋白在体外与DnaA盒的特异性结合。 他们发现， DnaA蛋白与DnaA盒保守序列TTGTCCACA的亲和力最高， 当DnaA盒序列的第四、 第七和第九位中的任何一个碱基发生变化，
就几乎检测不到DnaA蛋白的特异性结合。 Messer等[1]在E. coli复制起始研究中， 将DnaA盒分为强、
弱两类， 强的DnaA盒与保守序列只相差1～2个碱基。
在复制起始过程中， DnaA蛋白首先与强的DnaA盒结合， 这种结合会诱导DnaA蛋白与附近的弱的DnaA盒结合。 这些研究成果说明oriC中各个DnaA盒其序列保守性的差异， 是复制起始所需要的， 即通过每个DnaA盒保守性的不同， 使得这些DnaA盒在复制起始过程中， 与DnaA蛋白结合存在一定的先后顺序，
从而诱导oriC序列进入正确的构型， 并最终与复制有关酶组装成正确的有复制活性的开放复合体(Open complex)[20]。

在头状链轮丝菌的DnaA盒中， 所有较保守的DnaA盒的第四、 第七位的碱基全部保守，
绝大多数在第九位保守(六个DnaA盒中只有一个第九位不保守)， 因此，
这些在第四、 七、 九位高度保守的DnaA盒很可能是DnaA蛋白最先结合的位点， 诱导oriC向有利于复制起始的构型转化， 并进一步诱导DnaA蛋白与其周边较弱的DnaA盒结合。

在头状链轮丝菌中， 较为独特的是第六位的C最保守， 其保守性甚至超过第四和第七位，
但有关第六位的C在DnaA蛋白与DnaA盒结合中的作用和意义尚未见研究报道， 在今后的工作中值得给予关注。

对oriC的功能研究表明， 头状链轮丝菌的oriC可以在不同属的变铅青链霉菌中正常启动复制[4]。 头状链轮丝菌oriC中的1～188位和793～939位的片段不包含DnaA盒结构。 采用缺失了1～188位片段的oriC构建的载体对变铅青链霉菌的转化效率为零， 即oriC活性完全丧失； 而缺失793～939位片段后， oriC活性下降了约41％。 这说明分别位于5′端和3′端的这两段不包含DnaA盒的序列是DNA复制起始的重要功能结构， 但两者在DNA复制过程中的作用和地位是不同的， 1～188位片段是DNA复制起始所必需的； 而793-939位片段的缺失造成转化效率的大幅下降，
提示该片段对DNA复制起始效率以及复制子稳定性等方面可能具有重要作用。

当oriC两端带上部分dnaA、 dnaN基因片段时，
虽然转化效率下降到原来的12.5%， 但转化子的菌落、 菌丝形态较健康， 菌丝中原核较大。 可能的解释包括质粒的稳定性较高、 与染色体相容性较好等。
Madiraju等[16]曾报道， 以鸟分枝杆菌的oriC构建质粒时， 当插入片段包括oriC两端的dnaA、 dnaN和recF等基因时， 质粒稳定性可以提高40倍以上。 Madiraju等的实验结果和本实验的结果都暗示， oriC两端的dnaA和dnaN基因的序列除了具有编码各自基因产物外，
可能同时还对染色体复制起始具有顺式调控作用。

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Updated at: 2003-10-09