Expression
of a Human Ribonuclease Inhibitor Variant in Escherichia coli and
Silkworm Insect Cell (Bombyx mori)

Huang Guang-Hua, Yang Guan-Zhen, Chen Jiang-Ye*, Wu Xiang-Fu*

( State
Key Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai
Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai
200031, China)

Abstract        Ribonuclease
inhibitor (RI) is an acidic 50 kD protein with a high content of leucine and
cysteine residues. RI inhibits RNases of the pancreatic type. A variant of RI
was cloned from human fetal liver cDNA library by polymerase chain reaction
(PCR). Compared with the reported 
RI, only two variations Arg359Ala and Leu365Pro were found in RIv amino
acid sequence. Recombinant RIv has been expressed both in Escherichia coli and
silkworm insect cells (Bombyx mori). The recombinant RIv exhibited inhibition
activity on ribonucleolytic activity of RNase A in vitro system.

Key
words     human
RNase/angiogenin inhibitor variant (RIv); expression in Escherichia coli;
expression in silkworm cells (Bombyx mori)

___________________________________________

Received: June
11, 2003        Accepted:
July 1, 2003

* Corresponding authors:

CHEN Jiang-Ye: Tel, 86-21-54921251; Fax,
86-21-54921011; e-mail, [email protected]

WU Xiang-Fu: Tel, 86-21-54921253; Fax,
86-21-54921011; e-mail, [email protected]

核糖核酸酶抑制蛋白变体RIv在大肠杆菌和家蚕细胞中的表达

黄广华     杨冠珍     陈江野*    吴祥甫*

( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室， 上海 200031 )

摘要       人源的核糖核酸酶抑制蛋白(ribonuclease inhibitor,
RI) 是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质， 分子量为50 kD。 从人胚胎肝cDNA文库中克隆到一个核糖核酸酶抑制蛋白RI基因的变体(ribonuclease
inhibitor variant, RIv)。 序列分析表明， 与RI相比较， RIv序列中仅有Arg359Ala和Leu365Pro两个氨基酸突变， 而核苷酸同源性较低， 为78％。
将RIv克隆于pET28a(+), 并转化大肠杆菌BL21（DE3）， IPTG诱导表达， 利用6×His亲和层析柱纯化得到了His-RIv重组蛋白。 将RIv克隆于转移载体pBacPAK8， 利用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）表达系统表达得到重组RIv。 体外活性测定实验表明， 重组RIv具有抑制牛胰RNase A酶解28 S和18 S rRNA的作用。

关键词   核糖核酸酶抑制蛋白; 大肠杆菌表达; 家蚕细胞表达

核糖核酸酶抑制蛋白(ribonuclease inhibitor, RI)是一种富含亮氨酸和半胱氨酸残基的酸性蛋白质，
由15个串联的同源结构域组成，
其二级结构呈对称的马蹄形结构[1,2]。 RI 在高等动物的许多组织中均有表达，
胎盘中表达量最高。 RI能抑制胰脏来源的RNA酶（RNases of pancreatic type）活性[3～5]。 RI与RNase紧密结合形成1:1的复合物， 其结合常数小于10－14， RI常用于mRNA和多聚核糖体的制备[3]。 RI 能抑制血管形成因子(angiogenin) 的RNA降解及促血管形成活性[5]。 因此， RI被认为是胚胎发育、伤口愈合及肿瘤发生中新血管形成的一种调节因子，
可以作为抑制因子用于某些依赖血管形成的疾病[6], 也是一种潜在的抗肿瘤药物。

人的RI基因定位于11号染色体（11p15.5）。 在癌症患者中， 染色体11p15.5部位常常有变异， 因而RI可能与细胞的生长和分化相关[3]。 序列分析表明， 来源于人、大鼠和猪的RI氨基酸序列同源性约为70％[3,6～8]。 但其中27个半胱氨酸是保守的， 说明这些保守的半胱氨酸在RI的结构和功能中起重要作用。

我们利用PCR方法， 从人胚胎肝cDNA文库中克隆到了一个编码核糖核酸酶抑制蛋白的基因变体， 命名为RIv。
在大肠杆菌中表达并纯化了该蛋白质， 此重组蛋白质具有抑制RNase A的活性。 另外， 利用家蚕核型多角体病毒（BmNPV）表达系统在家蚕细胞(Bm
cell)中表达了RIv。

1    材料和方法(Materials and Methods)

1.1   材料

人胚胎肝λgt11 cDNA库购自Clontech 公司。 6×His抗体和Ni²⁺-IDA-Sepharose 6B购自Sigma公司。 PCR引物由上海生物工程公司合成。 Pfu， Taq DNA聚合酶等其他试剂购自Gibco BRL公司。 所有菌株、细胞和载体均由本实验室保存。

PCR引物: Lambda p1， 5′-GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC C-3′； Rip2， 5′-CCA CTC
TTC ACC TCC ACC ATG-3′； Rip3， 5′-CCA TAT
GTC TCT GGA CAT CCA-3′； Rip4， 5′-GCC TCA
GGA GAT GAC CCT CAG G-3′。

1.2   方法

1.2.1       RIv的cDNA克隆        引物Lambda p1根据λgt11正向引物设计， Rip2根据已报道的RI基因设计[6]。 Rip3和 Rip4根据克隆到的RIv测序结果设计， 并分别引入NdeI和BamHI位点。 以99 ℃预先加热10 min的人胚胎肝λgt11 cDNA库为模板， Lambda p1和 Rip2为引物，
在94 ℃ 45 s、 54 ℃ 45 s、 72 ℃ 90 s的条件下， 经30个循环PCR反应扩增目的基因。 将PCR产物平端克隆于载体pBluescriptⅡSK(+)，
得到质粒pBSK-Lam1并测序。 为了在RIv可读框(ORF)的5′和3′端分别引入NdeI和BamHI位点，
以pBSK-Lam1为模板， Rip3和Rip4为引物，
在94 ℃ 45 s、 56 ℃ 45 s、 72 ℃ 90 s的条件下， 进行30个循环PCR反应扩增RIv。 将PCR产物平端克隆于pBSK(+)， 得到质粒pBSK-RIv。 RIv的GenBank 登录号为AY071904。

1.2.2       RIv在大肠杆菌中的表达与纯化        NdeI和BamHI酶切质粒pBSK-RIv， 将RIv克隆于pET28a(+)， 得到大肠杆菌表达质粒pET-RIv（图1）。 pET-RIv转化大肠杆菌BL21（DE3）， 挑选转化子， 在加入50 mg/L卡那霉素的LB培养基中， 37 ℃振荡培养过夜。 过夜菌1:100接种于LB培养基中， 37 ℃振荡培养至A值为0.6，
加1 mmol/L IPTG诱导， 继续培养3 h。 离心收集细胞， 1×PBS洗一次， 再重新悬浮于1×PBS中， 超声波破碎细胞。 将样品5000 r/min 离心5 min， 取上清液18 000 r/min离心20 min。 收集上清液和沉淀部分。 SDS-PAGE和Western 印迹分析表明， 表达产物富集于包含体中。 纯化和复性方法参照文献[9]，  略作改进。
用缓冲液（6 mol/L盐酸胍、0.5 mol/L NaCl、 5 mmol/L咪唑、 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9）溶解包含体， 并用Ni2＋-IDA-Sepharose
6B 亲和柱纯化， 分管收集目的蛋白质。
在4℃，
样品和透析复性缓冲液按体积比1:10进行透析复性36 h。 透析复性缓冲液为1 mmol/L EDTA、 150 mmol/L NaCl、 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.9)、 2 mmol/L还原型谷胱甘肽、 0.15 mmol/L氧化型谷胱甘肽。 将复性后的样品冷冻干燥。

1.2.3       RIv在家蚕细胞中的表达     XhoI和SacI酶切质粒pBSK-RIv， 将RIv克隆于转移载体pBacPAK8（图1）。 得到的重组载体pBacPAK-RIv与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK DNA共转染家蚕细胞， 待4～6天之后细胞出现病毒感染症状， 再进行空斑筛选， 并用点杂交验证重组病毒[10]。 重组病毒命名为Bm-BacPAK-RIv。 取Bm-BacPAK-RIv感染家蚕细胞， 72 h后收集细胞， SDS-PAGE电泳检测RIv在家蚕细胞中的表达情况。

Fig.1       Construction
of E. coli expression plasmid pET-RIv and Bm cell expression transfer plasmid
pBacPAK-Riv

1.2.4       重组RIv核糖核酸酶抑制活性的检测       用Trizol RNAgents从家蚕细胞抽提总RNA。 RNase A核酸裂解活性的抑制实验参照文献[4]。 80 ng纯化的重组RIv蛋白与8 ng牛胰RNase A在缓冲液A[11] 中于室温放置20 min后， 加入20 μg家蚕细胞总RNA。 继续于室温温育30 min， 凝胶电泳检测18 S和28 S rRNA降解情况。

2    结果和讨论（Results and Discussion）

2.1   RIv cDNA克隆与序列分析

根据λgt11正向引物和RI的核苷酸序列， 设计引物， PCR方法扩增含RI的cDNA，
将该cDNA片段克隆于pBSK(+)， 测序并进行序列分析。 RIv与已报道的RI基因推测的氨基酸序列同源性很高[6]， 仅有Arg359Ala和Leu365Pro两个氨基酸不同。 但两者核苷酸序列同源性比较低， 全序列中存在多个氨基酸密码子同义突变。
这些变异多数为GC碱基向AT碱基的变异，
因此RIv的GC碱基含量远低于RI基因， 前者为53％， 后者为65％。 表1分析了小鼠、猪、黑猩猩和人的RI及RIv基因核苷酸序列和蛋白质序列同源性，
这些物种RI基因蛋白质序列同源性约70％， 但人的RI及RIv基因蛋白质序列同源性高达99％(表1)。 原位杂交和人类基因组测序表明， RI定位于11号染色体， 只有一个拷贝[3]。 因此我们认为RIv是RI的一个变体。

Table 1   Comparison
of the RIv sequence to the other RI sequences

Homologies of nucleotide sequences (up the solidus) and deduced amino
acid sequences (down the solidus) of RIv, RI, mRI and RI. Data were taken from
the GenBank database， compared with Blast 2 programme. Accession No: RIv, AY071904; RI,
M22414; mRI, BC010331; pRI, M58700; cRI, AAN10133. mRI, mouse RI; pRI, pig RI;
cRI, chimpanzee RI; nt, homology of nucleotide sequences; aa, homology of
deduced amino acid sequences.

2.2   RIv在大肠杆菌中的表达与纯化

将RIv cDNA克隆于pET28a(+), 得到表达质粒pET-RIv(图1)。 将pET-RIv转化大肠杆菌BL21（DE3）。 在LB培养基中培养并收集细胞用于电泳分析。 SDS-PAGE电泳结果表明， 大部分重组蛋白质分布于包含体中。 利用6×His亲和层析柱纯化得到了目的蛋白质， 表达菌总蛋白质、
包含体和纯化的重组蛋白质经SDS-PAGE电泳[图2(A)]， Western 印迹分析检测证明50 kD处条带是目的重组蛋白质[图2(B)]。

Fig.2       Expression
of RIv in E. coli

(A) SDS-PAGE analysis of RIv expression
in E. coli. 1, non-induced bacterial lysates(control); 2, IPTG induced
expression bacterial lysates; 3, inclusion body pellets; 4, purified
recombinant RIv. (B) Western blot analysis. 1, non-induced expression bacteria
(control); 2, IPTG induced expression bacteria. Monoclonal anti-polyhistine
antibody was used as an antibody.

2.3   RIv在家蚕细胞中的表达

将RIv的cDNA克隆于转移载体pBacPAK8， 得到pBacPAK-RIv。 pBacPAK-RIv与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK DNA共转染家蚕细胞， 筛选空斑， 经点杂交验证获得重组病毒Bm-BacPAK-RIv。 选择三株重组病毒分别感染家蚕细胞， 72 h之后观察细胞状态， 并收集细胞， 进行SDS-PAGE分析。 在三株重组病毒感染的家蚕细胞中都检测到一条约50 kD的外源蛋白质表达条带（图3）。 SDS-PAGE分析结果表明重组RIv蛋白在家蚕细胞中得到成功表达。

Fig.3       SDS-PAGE
analysis of RIv expressed in BmN cell

1, BmN cell infected with
mock-BmNPV(control); 2–4, BmN cell infected with recombined virus Bm-BacPAK-RIv. Three clones
were used for analysis. The arrow shows expressed RIv.

2.4   重组RIv蛋白抑制核糖核酸酶活性的检测

大肠杆菌表达纯化的重组蛋白质RIv复性后冷冻干燥。 重组RIv蛋白与牛胰RNase A[11]在缓冲液A中于室温预保温20 min后加入家蚕细胞总RNA。 1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解情况， 结果表明RIv能抑制RNase A酶解28 S和18 S rRNA（图4）。

Fig.4       Inhibiting
ribonucleolytic activity of RNase A

20 μg total RNA was added to incubated reaction buffer (50 mmol/L Tris-HCl,
30 mmol/L NaCl, pH 7.5)， room temperature 30 min. 1, 3 μL 0.1% DEPC; 2, 8 ng RIv; 3,
80 ng RIv and 8 ng RNase A; 4, 8 ng RNase A.

本实验中我们从人的胚胎肝cDNA文库中克隆到了一个核糖核酸酶抑制蛋白质基因的变体（RIv）。 RIv cDNA序列中存在许多氨基酸密码子同义突变， 而且RIv的GC碱基含量比较低， 这些突变可能影响基因在体内的表达[12]。 分析GenBank上提供的序列发现， 人的RI基因编码区和非编码区核苷酸序列常有变异。
另外， 和人的RI基因相比， 黑猩猩（Pan troglodytes）的RI基因存在Arg359Gln变异[13]。
说明RI基因在第359个氨基酸位置比较容易突变。

RI能抑制胰脏来源的RNA酶的活性。 这种抑制作用通过RI与RNase紧密结合形成1:1的复合物而使RNase失活。 RI由15个串联的同源结构区组成， 二级结构上表现为α螺旋和β折叠相间的马蹄型。
与RI相比， RIv的两个突变为Arg359Ala和Leu365Pro， 位于第六个α螺旋的末端。 尽管Leu365Pro突变使RIv提前3个氨基酸终止了α螺旋， 计算机模拟结构表明， RIv的两个突变对其二级结构没有较大影响。 我们的结果证明了大肠杆菌表达的重组RIv仍具有RNase A的抑制活性。

RI也是血管形成因子（angiogenin）的抑制因子， 可用于开发血管形成依赖疾病的治疗(例如抑制肿瘤)的药物。 目前主要是从人胎盘中提取RI蛋白， 产量有限，
而且胎盘来源的RI用作药物存在感染的危险。 我们用大肠杆菌和家蚕细胞表达了RIv， 大肠杆菌表达产物具有抑制RNase A活性， 为RIv在生物制药方面的应用打下了良好的基础。

References

1     Kobe
B, Deisenhofer J. Crystal structure of porcine ribonuclease inhibitor, a
protein with leucine-rich repeats. Nature, 1993, 366(6457): 751－756

2     Chen
CZ, Shapiro R. Site-specific mutagenesis reveals differences in the structural
bases for tight binding of RNase inhibitor to angiogenin and RNase A. Proc Natl
Acad Sci USA,
1997, 94(5): 1761－1766

3     Hofsteenge
J. Ribonuclease inhibitor. In: D’Alessio G, Riordan JF, eds. Ribonucleases:
Structures and Functions. New York:
Academic Press, 1997

4     Lee
FS, Shapiro R, Vallee BL. Tight-binding inhibition of angiogenin and
ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor. Biochemistry, 1989, 28(1):
225－230

5    Shapiro
R, Vallee BL. Human placental ribonuclease inhibitor abolishes both angiogenic
and ribonucleolytic activities of angiogenin. Proc Natl Acad Sci USA, 1987,
84(8): 2238－2241

6     Schneider
R, Schneider-Scherzer E, Thurnher M, Auer B, Schweiger M. The primary structure
of human ribonuclease/angiogenin inhibitor (RAI) discloses a novel highly
diversified protein superfamily with a commom repetitive module. EMBO J, 1988,
7(13): 4151－4156

7     Hofsteenge
J, Kieffer B, Matthies R, Hemmings BA, Stone SR. Amino acid sequence of the
ribonuclease inhibitor from porcine liver reveals the presence of leucine-rich
repeats. Biochemistry, 1988, 27(23): 8537－8544

8     Kawanomoto
M, Motojima K, Sasaki M, Hattori H, Goto S. cDNA cloning and sequence of rat
ribonuclease inhibitor, and tissue distribution of the mRNA. Biochem Biophys
Acta, 1992， 1129(3): 335－338

9     He
HJ, Yuan QS, Yang GZ, Wu XF. High-level expression of human extracellular
superoxide dismutase in Escherichia coli and insect cells. Protein Expr Purif,
2001， 24(1): 13－17

10    Tian
E, Yang GZ, Cai YM, Shi FH, Wu XF. Studies on the expression of the 28 kD
glutathione S-transferase gene from Schistosoma japonicum in the silkworm
(Bombyx mori) larvae and insect cell. Acta Biochim Biophys Sin, 1997, 29(1): 33－39

11    Lee
FS, Vallee BL. Expression of human placenta nuclease inhibitor in Escherichia
coli. Biochem Biophys Res Commun, 1989, 160(1): 115－120

12   Fennoy
SL, Bailey-Serres J. Synonymous codon usage in Zea mays L. nuclear genes is
varied by levels of C and G-ending codons. Nucleic Acids Res, 1993, 21(23):
5294－5300

13    Zhang
J, Webb DM, Podlaha O. Accelerated protein evolution and origins of
human-specific features: FOXP2 as an example. Genetics, 2002, 162(4): 1825－1835

Updated at: 2003-10-14