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Co-expression
of CFA/I and CS6 of Enterotoxigenic Escherichia coli ( ETEC ) in
Shigella flexneri 2a T32 Derivative Strain FWL01
ZHENG Ji-Ping, WANG
Ling-Chun, WANG Peng, LUO Gang, LI Shu-Qin, DUAN Hai-Qing,
HUANG Cui-Fen, ZHANG Zhao-Shan*
( Beijing Institute of Biotechnology, Beijing 100071, China )
Abstract Among
the known colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)
, CFA/I and CS6 (the common antigen in the CFA/IV fimbrial antigens ) are
two of the most prevalent fimbriae found in clinical isolates but are never
expressed by the same wild-type strains. In this study, CFA/I and CS6 of ETEC
were co-expressed in Shigella flexneri 2a T32 derivative strain FWL01
by using a host-plasmid lethal balancing system based on asd gene.
The results indicate that the recombinant plasmid carrying CFA/I and
CS6 could be stably integrated in FWL01. Expression of the two antigens
did not interfere the host growth. The results of immunofluorescence analysis
showed that CFA/I and CS6 were localized on the surface of the strain FWL01.
In Balb/c mice orally immunized with the recombinant strain, the immune responses
against CFA/I and CS6 were observed. Those observations show the feasibility
of a multivalent vaccine expressing different fimbrial antigens in attenuated
Shigella flexneri.
Key words enterotoxigenic
E.coli; CFA/I; CS6; Shigella flexneri; vaccine
肠毒素大肠杆菌定居因子CFA/Ⅰ和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达
郑继平 王令春 王罗刚 李淑琴
段海清 黄翠芬 张兆山*
（北京生物工程研究所， 北京 100071）
摘要
定居因子CFA/I和CS6是肠毒素大肠杆菌(ETEC)中重要的两种优势抗原， 是ETEC疫苗研制的首选组分。 采用基因重组技术将二者构建在以asd基因为选择标记的重组质粒上，
与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL01构成宿主-载体平衡致死系统。 实验结果表明, 重组疫苗候选株能够稳定表达CFA/I和CS6抗原, 并可在菌体表面形成相应菌毛。
重组菌口服免疫BALB/c小鼠后， 可诱生相应的抗CFA/I和CS6的特异性血清抗体IgG和分泌型抗体sIgA， 说明以志贺氏菌为载体， 可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗。
关键词 肠毒素大肠杆菌；
CFA/I； CS6； 减毒福氏志贺氏菌; 多价疫苗
肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic
Escherichia coli, ETEC）是造成发展中国家婴幼儿和旅游者细菌性腹泻的主要致病菌之一。 其表面定居因子抗原（colonization
factor antigens, CFAs）和肠毒素（enterotoxins）共同作用导致腹泻， 是ETEC疫苗的重要成分。 在已发现的CFAs中，
CFA/I、CS6和CS3在流行的ETEC中是分布最为广泛的3种优势菌毛抗原［1］。
痢疾杆菌同ETEC一样是在WHO报告中重点列出的细菌性肠道致病原， 是引起腹泻的主要病原菌之一。 减毒痢疾杆菌可有效表达和传递ETEC抗原， 刺激机体产生相应的血清IgG和黏膜sIgA抗体，
同时不影响自身抗原表达和免疫原性， 达到对痢疾杆菌和ETEC的双重保护。以减毒痢疾杆菌为宿主表达ETEC抗原是目前研制ETEC多价菌苗的一种有效方法［2～4］。
本实验通过含asd基因的、非抗生素抗性重组质粒与缺失asd基因的减毒痢疾杆菌构成宿主-载体平衡致死系统， 在不需要疫苗中禁用抗生素选择压力的条件下，
在同一菌株中同时表达两种ETEC定居因子抗原CFA/I和CS6， 是构建多价疫苗的有益尝试。
1 材料和方法（Materials and Mathods）
1.1 材料
1.1.1 细菌与质粒见表1。
Table 1 Bacteria
and plasmids used in this research
| Strain and plasmids | Characteristics | Source |
| E.coli | ||
| E44813 | CFA/I+, LT+, ST+ |
NICPBP |
| E519/66A | CS6+, LT+, ST+ |
Prof.Svennerhom |
| X6097 | Asd– | Dr.Roy |
| S.flexneri | ||
| FwL01 | (ipa-virg)–, SmR, Asd–ctxB+ |
Dr.Wang |
| Plasmids | ||
| pMG235 | CS6+, ampR | Dr.Yang |
| pZHY21 | CFA/I+, asd+ | Mr.Zhang |
| ］pZCF16 | CFA/I+, CS6+, asd+ |
This study |
1.1.2 试剂 限制性内切酶、修饰酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。 二氨基庚二酸（DAP）购自Sigma公司， 化学试剂均为分析纯。
1.1.3 培养基 LB培养基； CFA固体培养基： 10 g/L水解酪蛋白、1.5 g/L酵母粉、0.05 g/L MgSO4・7H2O、
0.005 g/L MnCl2、15 g/L琼脂粉， 调节pH值至7.4。
1.1.4 纯化抗原、抗体 CFA/I纯化抗原、CS6纯化抗原和CS6抗血清由本室制备。 CFA/I单克隆抗体由瑞典Ann-Mari
Svenneriholm 教授惠赠。 HRP标记羊抗兔IgG和FITC标记羊抗兔IgG购自北京欣经科生物技术有限公司。 HRP标记羊抗鼠IgG和sIgA均为Sigma公司产品。
1.2方法
1.2.1重组质粒的构建 见图1。 CS6基因用PCR扩增的方法从质粒pMG235上获得， 上、下游引物分别依据trp启动子和CS6基因3′末端序列设计。
P1， 5′-TCGGGGCTCACATCATAACGGTTCT-G3-′； P2， 5′-TGGCCAAGGCTGCAGGTCGACGGTAT-3′。
为操作方便， 上游引物(P1)设计有BanII酶切位点， 下游引物(P2)设计有EcoT14I酶切位点。 扩增方法为94 ℃预变性4 min， 然后扩增30个循环：
94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min， 最后72 ℃延伸10 min。
Fig.1 Construction
of plasmid pZCF16
1.2.2 CFA/I、CS6菌毛粗提物的制备
野生菌或重组菌在CFA平板上37 ℃过夜培养16～18 h后， 用0.1 mol/L PB悬浮， 低速离心， 等体积的0.1 mol/L PB重悬菌体，
60 ℃水浴30 min， 剧烈振荡1 min， 12 000 g离心20 min， 去除菌体， 上清液65 000 g超离心1.5 h。 由于完整的CFA/I和CS6菌毛分子量不同，
通过离心可使CFA/I和CS6菌毛基本分离， 沉淀为分子量大的CFA/I菌毛粗提物， 分子量小的CS6菌毛分布在上清液中。 对上清液进行30%和50%饱和硫酸铵二级沉淀，
12 000 g离心30 min， 用适量的0.1 mol/L PB溶解、透析沉淀， 即为CS6菌毛粗提物。 对超离心沉淀的CFA/I菌毛用0.1
mol/L PB悬浮， 然后进行40%和60%饱和硫酸铵二级沉淀， 离心、溶解、透析后即为CFA/I菌毛粗提物。
1.2.3 SDS-PAGE电泳和Western印迹 按照参考文献［8］的方法进行。
1.2.4 免疫荧光显微镜观察 采用离心管法［9,10］用0.01 mol/LPBS收获CFA平板上的重组菌， 洗3遍后重悬浮， 3%
BSA封闭30 min, 洗一遍， 加相应血清抗体， 对照用0.01 mol/L PBS代替血清抗体， 37 ℃反应1 h， 洗3遍， 加FITC标记羊抗兔IgG，
37 ℃作用1 h, 洗3遍， 适量0.01 mol/L PBS重悬浮， 加一滴到载玻片上， 免疫荧光显微镜观察。
1.2.5 质粒稳定性实验［11］和菌体生长曲线［12］质粒稳定性实验的方法为每隔12 h重组菌培养物以1%量接种到新的LB液体培养基中培养，
如此连续转接种培养50 h以上， 保证菌体传至100代后， 稀释培养物106倍， 取100 μL涂布普通LB平板， 过夜培养后，
随机挑取100个单菌落， 转接种到另一普通LB平板上， 过夜培养并进行菌落记数。 随机挑选10个菌落， 进行全菌PCR进一步验证质粒是否正确。 对照采用含DAP的LB培养基培养重组菌，
最后随机挑选100个单菌落， 转接种到不含DAP的普通LB平板上， 过夜培养后进行菌落记数， 全菌PCR进一步检验质粒。
1.2.6 动物免疫 选用6～8周龄雌性Balb/c小鼠， 免疫前禁食2 h， 然后用钝头针灌胃100 μL饱和NaHCO3, 20
min后以200 μL高（约2×109CFU）、低（约2×108CFU）两种剂量分组灌胃, 每组5只。 对照组用0.01 mol/L PBS代替。
隔周免疫， 共3次。
1.2.7 血清IgG样品制备 免疫前和免疫两周后采血， 室温放置30 min， 8000 g离心5 min， 上清液－20
℃保存备用。
1.2.8 sIgA样品制备 新鲜粪便sIgA制备： 取免疫前和免疫两周后小鼠的新鲜粪便， 以4 mL/g加0.01 mol/L PBS、
0.05 mol/L EDTA缓冲液悬浮， 冰上不时震荡15 min， 4 ℃ 8000 g离心5 min， 上清液－20 ℃冻存；
肠液sIgA收集： 最后一次采血后取小肠3 cm， 剪碎后加400 μL 0.01 mol/L PBS、 0.05 mol/L EDTA悬浮， 冰上不时震荡10
min， 4 ℃ 8000 g离心5 min， 上清液－20 ℃冻存。
1.2.9 酶联免疫吸附（ELISA）检测血清抗CFA/I和CS6特异性抗体IgG和粪便及肠液分泌型抗体sIgA［13,14］。
2 结果(Results)
2.1 重组质粒和重组菌的构建
质粒pZHY21由pBR322分别在terR、ampR抗性基因处插入CFA/I和asd基因重组而来。
质粒pMG235的CS6基因在trp启动子的作用下高效表达。 FWL01是减毒疫苗福氏志贺氏菌2a T32 (△［ipa-virG］, SmR)的asd基因缺失突变株。
用PCR的方法获取质粒pMG235上的Trp-CS6片段， 连接到质粒pZHY21， 电转入FWL01。 因为asd基因负责编码的天冬氨酸β-半醛脱氢酶，
是细菌的赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、二氨基庚二酸（DAP）合成途径中的一个关键酶， 尤其DAP是构成G-细菌细胞壁上肽聚糖的基本成分， 不能合成就会导致溶菌死亡［15］，
所以没有转入质粒的S.flexneri FWL01不能在LB平板上生长， 经LB平板初筛后， 提取质粒， 经PCR鉴定， 酶切图谱分析初步得到新的重组质粒pZCF16。
2.2 SDS-PAGE电泳和Western印迹
重组菌FWL01（pZCF16）同时表达CFA/I和CS6， 而CFA/I的结构蛋白B亚基和CS6的结构蛋白大小几乎一致， 都约为15 kD，
电泳无法分开， 因此如何鉴别重组菌CFA/I和CS6蛋白是本实验的难点之一。 根据完整菌毛CFA/I和CS6的形态和分子大小， 热脱毛后， 在进行硫酸铵分级沉淀之前，
采用直接超离心的方法使多聚体大分子CFA/I菌毛形成沉淀， 小分子膜蛋白CS6菌毛仍保留在上清液的方法， 将二者分开， 再分别进行分级硫酸铵沉淀进一步提纯。
依此方法提取的CFA/I和CS6粗提物进行SDS-PAGE电泳， 然后各自分别与CS6抗血清和CFA/I单克隆抗体进行免疫印迹验证。 结果显示所提取的CFA/I和CS6粗提物只与相对应的CFA/I单克隆抗体或CS6抗血清产生蛋白质免疫印迹反应，
证实重组菌同时表达了15 kD左右的CFA/I和CS6蛋白， 按照上述的分离提取方法可完全将CFA/I和CS6蛋白区分开（图2）。 蛋白质印迹实验结果也证明，
表达产物具有特异的抗原性（图3）。
2.3 重组菌的免疫荧光显微镜观察
CFA/I和CS6是ETEC上的表面菌毛， 在肠道内能够结合其特异性受体， 激发肠道黏膜免疫应答。 因此重组菌只有在表面形成CFA/I和CS6菌毛，
才能发挥有效的免疫作用。 免疫荧光显微镜结果显示重组菌能够与CFA/I和CS6的特异性抗血清IgG抗体发生结合， 说明CFA/I和CS6可以在重组菌表面形成相应的菌毛（图4）。
2.4 质粒稳定性和菌体生长曲线
对于载体疫苗， 外源抗原基因表达的稳定性直接关系到疫苗的有效性。 只有持续稳定的表达和释放外源抗原， 工程疫苗才能有效的刺激机体的免疫应答，
提高对机体相应的免疫保护。 质粒稳定性实验表明， 在没有抗生素选择压力下， 用含DAP的LB培养重组菌100代后， 随机挑选100个菌落转接到LB平板，
过夜培养后只有60个菌落生成， 说明在失去asd基因的选择压力下， 重组质粒的丢失率高达40%； 而倚赖asd基因宿主-质粒平衡致死系统, LB培养100代后，
重组质粒没有丢失， 说明倚赖asd基因宿主-质粒平衡致死系统， 保证了重组质粒的稳定性。 菌体生长曲线显示重组菌生长良好， 与对照FWL01几乎一致，
说明重组质粒的表达对重组菌自身生长代谢没有造成多大影响。
Fig.2 SDS-PAGE analysis of FWL01(pZCF16)
(A) 1, protein marker; 2, positive control: CFA/I of E44813; 3, CFA/I
of FWL01(pZCF16).(B) 1, protein marker; 2, positive control: CS6 of E519/66A;
3, CS6 of FWL01(pZCF16).
Fig.3 Western blotting
analysis of FWL01(pZCF16)
(A) Hybridization by CFA/I monoclonal antibody (McAb). 1, protein marker;
2, positive control: CFA/I of E44813 ; 3, CFA/I of FWL01(pZCF16); 4, CS6 of
FWL01(pZCF16).(B) Hybridization by anti-CS6 serum. 1, protein marker; 2, CS6
of FWL01(pZCF16); 3, positive control: CS6 of E519/66A; 4, CFA/I of FWL01(pZCF16).
Fig.4 Immunofluorescence microscope analysis of FWL01(pZCF16)
(A) Detection by CFA/I monoclonal antibody (McAb). (B) Detection by anti-CS6
serum.
2.5 抗体效价的测定
以野生菌制备的CFA/I和CS6菌毛粗提物包被酶联板， 夹心ELISA法测定抗体效价。 免疫前Balb/c小鼠测不到相应的血清IgG和黏膜sIgA抗体，
3次免疫后， 抗CFA/I和CS6血清抗体IgG明显增高， 抗体效价分别达到了24 000和30 000（图5）。 对制备的新鲜粪便和肠液sIgA进行1∶100稀释测定A492值显示产生了特异性抗体黏膜sIgA(表2)。
说明重组菌能够激发机体的抗CFA/I和CS6的特异性体液和黏膜抗体反应。
Fig.5 The log of
titers of antibody IgG raised against CFA/I and CS6 in BALB/c mice immunized
by oral route with FWL01 (pZCF16)
Table 2 ELISA detection
of sIgA in BALB/C immunized by oral route (A492)
| Antibody | Fecal | Intestinal |
| Negative control | 0.063±0.015 | 0.066±0.004 |
| Anti-CFA/I | 0.284±0.019 | 0.544±0.065 |
| Anti-CS6 | 0.306±0.025 | 0.526±0.043 |
3 讨论（Discussion）
ETEC疫苗发展已有20多年， 尽管研制了多种疫苗（早期的亚单位疫苗、载体疫苗、减毒活菌苗、DNA疫苗和植物疫苗等）， 但遗憾的是至今还没有一种可应用于人体。
主要原因在于自然界ETEC CFAs种类多和区域分布差异， 给疫苗的研制带来很大困难。 由于ETEC腹泻是由定居因子和肠毒素共同作用产生的， 所以无论是纯化的菌毛疫苗或类毒素疫苗，
其免疫性必定是不完善的。 死菌苗尽管可以通过混合表达不同菌毛抗原的菌株， 以达到多价的目的， 但是， 死菌苗免疫效果不理想， 特别是免疫持续性差。
载体疫苗多为口服活菌苗， 是利用活的疫苗株做载体， 表达外源的保护性抗原。 特点是用量少， 不需纯化， 免疫接种后靠重组菌在机体内繁殖产生保护性抗原，
刺激机体的特异免疫应答, 同时载体还可起佐剂作用， 是较为理想疫苗类型［1］。
美国马里兰大学疫苗开发中心研究人员正利用减毒志贺菌为载体， 致力于研制一种以5种最常见和主要的血清型减毒志贺菌为宿主、各自表达1种或多种ETEC
定居因子CFAs和LTM肠毒素的混合菌苗， 从而达到对志贺菌和ETEC的双重预防［2～4］。 但是混合活菌苗不仅生产制备繁琐， 费用高， 而且还存在着生长差异问题。
定居在肠道中的混合菌苗中的优势生长菌可能会替代弱势生长菌， 从而使预期的免疫效果下降。 本研究将ETEC的两种优势菌毛抗原CFA/I和CS6构建在同一重组质粒上，
依靠质粒-宿主平衡致死系统实现共表达， 基本上解决了上述问题。 与单一表达CFA/I和CS6减毒志贺菌混合免疫的结果比较显示， 共表达减毒志贺菌的免疫效果要稍好于混合菌（另文发表）。
说明以减毒志贺菌为宿主， 同时表达多个ETEC定居因子抗原， 是更理想的ETEC候选疫苗株， 这样更利于生产和降低成本。
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Received: July 22, 2003 Accepted:
August 25, 2003
This work was supported by the grants from the National High Technology Research
and Development Program of China (863 Program) (No. 2001AA215211) and the Military
Basic Research Foundation (No. 01Z026)
*Corresponding author: Tel, 86-10-63834140; Fax, 86-10-63833521; e-mail, [email protected]
Updated at: 12-18-2003