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Transgenic
Potato Containing Immunogenic Gene of Avian
Coronavirus and Its Immunogenicity in Mice
WU Jian-Xiang1,2,
ZHOU Ji-Yong1*, ZHOU Xue-Ping2
( 1Institute of Preventive Veterinary Medicine and 2Institute of Biotechnology,
Zhejiang University, Hangzhou 310029, China )
Abstract To check the feasibility
of expression of the immunogenic gene of avian coronavirus infectious bronchitis
virus (IBV) in plants, the transformation of S1 gene of IBV into potato and
the immunogenicity of its expression product was studied. The S1 gene of IBV-ZJ971
strain was inserted into plasmid pBI121 under the control of 35 S promoter.
Agrobacterium fumefaciens EHA105 with the recombinant vector pBI121
was obtained by tri-parental mating method. So, an efficient potato transformation
system mediated by Agrobacterium fumefaciens was established. The rates
of calli and shoots differentiation were 100%, and more than 95% respectively,
for transgenic potato with S1 gene of IBV. PCR and Southern blot analyses
showed that IBV S1 gene was integrated into genomic DNA of the potato plant
and most transgenic plants had two copies of S1 gene of IBV. In our experiments,
47 transgenic plantlets have been obtained. Northern blot and ELISA analyses
indicated that most transgenic plants could normally transcribe and translate
S1 gene of IBV, though the levels of transcription and translation were different
in various transgenic plants. Immunity assay with BALB/C mice showed that
expression products of transgenic potato with S1 gene of IBV were immunogenic,
and ELISA antibody titer reached 1∶20 to 1∶40 and 1∶80 to 1∶160 with doses
of 0.5 g and 1 g, respectively. Virus neutralization (VN) antibodies were
detected by tracheal organ cultures, and the results showed that VN titers
reached respectively 1∶160 to 1∶320
and 1∶320 to 1∶2048 with doses of 0.5 g and 1 g.
Key words chicken; coronavirus;
immunogenic gene; transgenic potato; immunogenicity
转禽冠状病毒免疫原基因马铃薯及其对小鼠的免疫原性
吴建祥1, 2周继勇1*周雪平2
( 1浙江大学动物预防医学研究所, 杭州 310029; 2浙江大学生物技术研究所, 杭州 310029 )
摘要
为了探索禽冠状病毒免疫原基因在植物中表达的可行性， 将传染性支气管炎病毒(IBV)-ZJ971毒株S1基因定向克隆到pBI121质粒的35 S启动子下游。
用三亲交配法将重组质粒导入EHA105根癌农杆菌， 建立了一种由农杆菌介导的马铃薯转化体系， 其愈伤形成率达100%， 芽的分化率达95%。 经PCR和Southern
印迹检测证明, IBV S1基因已整合到植物基因组内， 获47株转基因植株。 Northern 印迹和ELISA分析表明， 转基因植株中IBV S1基因能正常转录和翻译。
转基因马铃薯的BALB/C小鼠免疫试验结果表明， 0.5 g和1 g剂量转基因马铃薯免疫小鼠, 21天后的抗体ELISA效价分别达1∶20～1∶40和1∶80~1∶160，
中和抗体效价分别达1∶165～1∶562和1∶330～1∶2048, 说明禽冠状病毒免疫原基因的转基因马铃薯表达产物具有免疫原性。
关键词 禽； 冠状病毒； 免疫原基因； 转基因马铃薯；
免疫原性
传染性支气管炎(infectious bronchitis,
IB)是由禽冠状病毒――传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种急性高度接触性传染病。 该病每年都会对养禽业造成巨大的经济损失。
自从1931年由Schalk和Hawn在美国报道以来［1］， 迄今已分离的毒株有数十株之多［2］， 已知血清型达20多种。 传染性支气管炎目前无特效的治疗方法，
主要使用IBV灭活苗和弱毒苗预防接种。 由于IBV灭活苗和弱毒苗均存在缺陷， 因此开发安全、 有效的新型疫苗对IB的控制具有重要意义。 自1983年首次报道植物的遗传转化以来［3］，
该项技术在合成有医疗价值的多肽、 蛋白质， 包括抗原、 抗体、 生物活性物质方面已得到广泛应用, 其中植物转基因疫苗的研究更引起了研究人员的重视［4］。
已有人报道用烟草、 马铃薯、 香蕉等植物表达HBsAg［4～6］； 用西红柿表达狂犬病病毒外壳蛋白［7］； 用马铃薯、 烟草表达诺沃克病毒外壳蛋白、
霍乱抗原、 大肠杆菌肠毒素B亚基［8～11］； 马铃薯、 玉米、 烟草表达猪传染性肠胃炎病毒的S蛋白等［12～14］。 这些表达产物能诱导机体产生特异性的抗体,
具有良好的免疫原性。
为了开发新型、 安全、 有效的禽冠状病毒基因工程疫苗， 我们进行了转基因马铃薯表达IBV免疫原基因及其表达产物对小鼠免疫原性的研究。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌DH5α， 根癌农杆菌EHA105， 植物表达载体pBI121, 含辅助质粒pRK2103的HB101和含IBV-ZJ971
S1基因的pBS质粒由本实验室保存［2］。
1.1.2 酶和生化试剂 各种限制性内切酶、 T4 DNA连接酶和Taq酶购自Promega 公司； PCR纯化试剂盒、 割胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均为德国Qiagen公司产品；
氨苄青霉素（Amp）、 卡那霉素(Km)、 链霉素(Sm)、 利福平(Rif)、 羧苄青霉素（Carb） 均为上海生工生物工程公司产品； 同位素［α-32P］dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司；
植物激素6-苄基腺嘌呤I(6-BA)、 2, 4-二氯苯乙酸（2, 4-D）、 萘乙酸(NAA)、 玉米素（ZT）、 赤霉素（GA3）、 矮壮素（CCC）等均为Sigma
产品； 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品； ELISA反应板购自丹麦Nunc公司； H120毒株的IBV活疫苗（批号为MC001504）由意大利FATR公司生产；
IBV-M41阳性血清由美国阿肯色大学家禽科学系Skeeles教授惠赠； 常用化学试剂为国产分析纯试剂。
1.1.3 组织培养基与植物材料 基础培养基由MS培养基无机成分(Murashige and Skoog, 1962)加B5培养基的有机成分(Gamborg,
1986)组成的； 愈伤诱导培养基为基础固体培养基添加2 mg/L 2,4-D + 0.3 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+100 mg/L
Km + 500 mg/L Carb组成, pH 5.7； 分化培养基为基础固体培养基+2 mg/L ZT +20 μg/L NAA +20 μg/L
GA3 +30 g/L蔗糖+100 mg/L Km +500 mg/L Carb组成。 东农303无菌马铃薯试管苗由本室保存。
1.1.4 实验动物 体重20 g 的SPF的BALB/C小鼠（４周龄）购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 植物表达载体构建 参照已发表的IBV-ZJ971株基因组序列设计PCR引物［2］。 为了便于外源基因与pBI121质粒35 S启动子下游的多克隆位点相连接，
在PCR引物5′端引入XbaI酶切位点、 3′端引入BamHI酶切位点。 5′端引物为： 5′-GCTCTAGA-ATGTTGGTAACACCTCTT-3′,
3′端引物为： 5′-CG-GGATCCTTAATAACTAACATAAGGGCA-3′。 PCR引物的扩增基因长度为1654 bp。 以含S1基因的pBS质粒为模板进行PCR扩增。
纯化的IBV S1基因PCR产物和pBI121质粒用XbaI和BamHI在37 ℃酶切， 酶切产物割胶回收后在16 ℃条件下T4 DNA 连接酶连接过夜。
连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞， 在含50 mg/L Km的LB固体培养基上抗性筛选。 碱法提取转化子质粒， 用PCR、 XbaI和BamHI双酶切、
用双脱氧法(Sanger法)测序鉴定重组质粒， 从而使IBV S1基因定向克隆到pBI121质粒的35 S启动子下游。 含禽冠状病毒免疫原基因植物重组表达载体经三亲交配导入EHA105根癌农杆菌。
1.2.2 马铃薯的转化、 筛选及再生 取马铃薯无菌苗， 用刀切成0.3～0.5 cm长度的茎段（不含侧芽）， 接种到不加任何抗生素的愈伤诱导固体培养基平板上面，
在光照强度为2000 Lx、 光照时间为16 h/天和温度为(24±2) ℃条件下预培养2天。
挑取根癌农杆菌菌落， 接种到5 ml YEP液体培养基(100 mg/L Km)中， 在28 ℃条件下振荡培养16～24 h， 然后取100 μl菌液接种到5
ml液体培养基中, 继续振荡培养到A600=0.4～0.5。 收集菌液12 000 r/min离心20 s, 去除上清液, 菌体用液体的MS基础培养基重新悬浮到A600=0.1～0.3。
将经过预培养的外植体放入菌体悬液作用5 min, 取出外植体, 用灭菌滤纸吸干, 立即放置在铺有一层灭菌滤纸的愈伤组织诱导培养基上， 于黑暗中共培养2～3天。
将已共培养的马铃薯外植体用无菌水漂洗3～5次, 用灭菌滤纸吸干， 接种到含抗性愈伤组织诱导的固体培养基平板上。 在温度为(24±2) ℃、 光照强度为2000
Lx、 光照时间为16 h/天下培养7天。
将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基上， 待抗性芽生长到2～3 cm时， 转接到生根培养基上形成完整的植株。
1.2.3 转基因植株的鉴定 再生植株的基因组的微量提取和PCR鉴定分别参照傅荣昭等［15］和周继勇［2］报道的方法进行。 转基因植株基因组的Southern印迹和Northern印迹分析按Ausubel等［16］
及Sambrook等［17］描述的方法进行。
1.2.4 马铃薯块茎中S1基因表达产物含量测定 转基因和非转基因马铃薯块茎用液氮研磨成粉末, 加5 mmol/L PBS(含0.025%
Tween-20)的可溶性总蛋白质提取液(1.0 g 块茎/ml)， 4 ℃放置60 min, 12 000 r/min离心5 min, 取上清液按Bradford［18］方法测定可溶性总蛋白质。
参照Streatfield等［14］的TAS-ELISA方法测定可溶性总蛋白质中转基因马铃薯S1基因表达产物含量。
1.2.5 转基因马铃薯表达产物的小鼠免疫原性测定 取BALB/C小鼠30只， 分别设立转基因马铃薯0.5 g组和1 g组（所用转基因马铃薯为C1植株的块茎抽提物）、
IBV-H120弱毒疫苗组（按生产厂家推荐剂量免疫）、 非转基因马铃薯组（1 g/只）及健康对照组（PBS）， 每组6只。 各组分别于0天、 7天、
14天实施灌胃免疫接种3次， 每次免疫接种前和第3次免疫接种后分别采血分离血清备用。 用IBV鸡血清包被， 以提纯的IBV为抗原， 小鼠免疫血清为一抗，
HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗， 进行TAS-ELISA测定小鼠免疫血清的ELISA效价， 小鼠免疫血清的ELISA效价和中和抗体效价测定方法分别按Streatfield等［14］和Zhou等［19］报道的方法进行。
2 结果(Results)
2.1 禽冠状病毒免疫原基因植物表达载体的构建与根癌农杆菌的转化
酶切纯化的IBV S1基因PCR产物经XbaI和BamHI酶切后定向插入pBI121载体上， 构建成含S1基因的中间载体pBI121/S1， 转化E.coli
DH5α， 抗性筛选， 重组子PCR和酶切、 用双脱氧法测序鉴定。 结果表明， IBV S1基因已被插入到植物中间表达载体pBI121中。 含IBV
S1基因的E.coli DH5α在pRK2013质粒的辅助下， 通过三亲交配的方式转化根癌农杆菌。 被转化的农杆菌在含Rif（100 mg/L）和Km(100
mg/L)的YEP培养基上抗性筛选， 碱法抽提转化体， 以设计的S1基因的特异引物进行PCR扩增。 结果表明， 大多数转化子均能扩增出与S1基因大小相同的片段，
即1.7 kb的条带， 而阴性对照未能扩增出相应的片段。 说明含IBV S1基因的植物表达载体已转入根癌农杆菌体内。
2.2 马铃薯的转化和再生植株的形成
预培养2天的马铃薯茎段外植体与携带有双元载体的根癌农杆菌EHA105共培养2天时， 可见根癌农杆菌的生长。 与农杆菌共培养过的外植体在愈伤诱导的抗性培养基上培养7天，
可见茎段两端形成明显的愈伤组织， 愈伤形成率为100%； 而没有与农杆菌共培养的外植体未见愈伤组织的形成， 且逐渐褪绿变黄而死亡。 形成的外植体愈伤组织在分化培养上培养时，
首先是外植体的愈伤组织继续生长、 变绿, 培养2周左右开始分化出不定芽， 3周左右95%的外植体分化出不定芽。 不定芽转接于生根培养基上4周后， 形成一个完整的再生植株。
非转基因的马铃薯芽因不能在生根培养基上生根而逐渐黄化死亡。 本研究共获50株再生植株。
2.3 再生植株基因组DNA的PCR和Southern印迹鉴定
以提取再生植株的基因组DNA为模板， 用构建植物表达载体pBI121的IBV S1基因的特异性引物进行PCR检测， 结果显示， 50个植株中有47株再生植株能够扩增出与目的基因大小一致的1.7
kb条带， 阳性率为94%, 而非转基因马铃薯的对照没有扩增出任何特异性条带(图1)。 取47株含有IBV S1基因特异性条带的转基因马铃薯， 用CTAB法大量提取植物基因组DNA。
25 μg植物基因组DNA用限制性内切酶EcoRI完全酶切后， 以［α-32P］标记的IBV S1基因为探针进行Southern杂交。 如图2所示，
Fig.1 PCR detection of the transgenic
plants
M, 1 kb DNA marker; CK, non-transformed potato; 2, 3, 5, 7, 8, 9, transgenic
potatoes containing IBV S1 gene.
Fig.2 Southern bolt analysis
of genomic DNA from transgenic potatoes
CK, non-transgenic potato; S1, IBV S1 gene; 2, 3, 5, 7, 8, 9, transgenic
potatoes transformed with IBV S1 gene.
所有PCR阳性的植株基因组DNA均能与IBV S1基因杂交,
拷贝数大多为2个， 也有1个的。 说明禽冠状病毒免疫原基因已整合到转化的马铃薯基因组内。
2.4 转基因马铃薯Northern印迹分析和IBV S1蛋白的表达量
Trizol抽提液提取Southern 印迹检测阳性的转基因马铃薯植株和非转基因马铃薯植株的总RNA， 以［α-32P］标记的IBV S1基因为探针，
进行Northern印迹分析， 结果显示， 所检测的多数转基因植物产生了特异性杂交斑点， 而非转基因的植株没有任何杂交斑点， 部份转基因植株基因组Northern印迹分析结果如图3。
多数转基因马铃薯中的IBV S1基因均能正常转录， 但转录水平有差异。 蛋白质含量测定结果显示, 不同转基因马铃薯植株IBV S1蛋白的表达量为3.64～11.4
μg/g。
Fig.3 Northern blot analysis
of the transgenic plants with IBV S1 gene
CK, non-transgenic potato; 1, 2, 3, 5, 7, 8, 9, C1, D1, transgenic potatoes
transformed with IBV S1 gene. rRNA, the ethidium bromide staining of rRNA
shows assessment of equal loading.
2.5 表达产物对BALB/C小鼠的免疫原性
本试验用0.5 g和1 g马铃薯剂量转基因马铃薯提取物灌胃免疫BALB/C小鼠， 每周1次， 共3次， 同时设IB弱毒活疫苗接种组， 非转基因马铃薯接种组和健康对照组。
在0天、 6天、 13天和21天各取血一次， 用TAS-ELISA和气管环中和试验分别检测免疫鼠血清的抗体效价和IBV的中和抗体效价。 结果表明，
0.5 g转基因马铃薯剂量组21天的免疫鼠血清的ELISA和中和抗体效价分别为1∶20～1∶40和1∶165～1∶562， 1 g转基因马铃薯剂量组21天的免疫鼠血清的ELISA和中和抗体效价分别为1∶80～1∶160和1∶330～1∶2048。
说明转基因马铃薯的IBV S1基因表达产物对鼠具有良好的免疫原性（表 1）。
Table 1 Murine virus neutralization
(VN) antibody responses against IBV
| Group | Immunized witha | Mice | VN titer |
| 1 | Transgenic potatoes (1 g) | 6 | 1∶330-1∶20482 |
| 2 | Transgenic potatoes (0.5 g) | 6 | 1∶165-1∶562 |
| 3 | IBV live vaccine | 6 | 1∶57 |
| 4 | Non-transgenic potatoes | 6 | 0 |
| 5 | Buffer | 6 | 0 |
aMice were immunized
three times by gastric application at day 0, 7 and 14.
3 讨论(Discussion)
疫苗是控制疫病流行的最重要手段， 现有的弱毒活疫苗和灭活苗在控制IB的流行过程中发挥了重要作用。 然而它们各自的缺陷又给疫病的控制造成了新的困难，
研制广谱、 有效、 安全的新型疫苗是人类和动物疫病控制的核心。 在安全性方面， 转基因植物具有其他疫苗制备载体无可比拟的优势。 因此在过去十年中，
许多细菌和病毒性疾病的免疫抗原用植物生产出来， 且具有优良的免疫原性［4～12］。 本试验中， 我们将禽冠状病毒免疫原基因转化马铃薯并表达， 其表达产物接种BALB/C小鼠后具有良好的免疫原性，
证实应用植物研制IB疫苗是可行的。
用PCR技术检测再生植株外源基因时， 所抽提基因组DNA的质量十分重要， 否则极易检测结果阴性。 本研究中针对马铃薯组织中酚类物质较多的特点， 在植物基因组DNA提取缓冲液中加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)至3%的终浓度，
可明显提高基因组DNA的抽提质量， 增加植物基因组中外源DNA的检出率， 使转基因植株外源基因的检出率达到94%。 Southern 印迹试验显示的结果与PCR一致，
从而在另一个角度证实了PCR结果的正确性， 同时Southern 印迹的结果也显示外源基因在进入植物基因组过程中的拷贝数是不同的。
根癌农杆菌作为植物遗传转化的载体， 因其介导的外源基因转化多数能稳定表达， 因此是国内外获得转基因植物的常用转化方法。 马铃薯是重要的粮食和蔬菜作物，
又是一种再生系统良好的植物， 本研究在前人的研究基础上， 通过改进激素和激素浓度， 建立了农杆菌介导的马铃薯转化体系， 使外源基因的转化频率达90%以上，
且转化周期只需2个月， 比文献报道的马铃薯转化体系［20， 21］ 的效率提高了20%， 转化周期缩短了1～2个月。
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Received: June
9, 2003 Accepted: July 28, 2003
This work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation
of China (No. 30070570) and Ministry of Education of China (No. 03086)
*Corresponding author: Tel/Fax, 86-571-86971698; e-mail,
[email protected]
Updated at: 12-18-2003