Yang Wei:Functional Characterization of Recombinant Myostatin and Its Inhibitory Role to Chicken Muscle Development

重组肌肉抑制素功能分析及其对鸡肌肉发育的抑制作用

杨威 王琨 陈岩 张勇 黄波 朱大海1*
( 哈尔滨工业大学分子与细胞发育生物学实验室， 哈尔滨 150001；
1中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005 )

摘要 肌肉抑制素（myostatin）为TGF-β超家族成员，
具有典型的TGF-β家族成员特有的分子结构与功能。 为了深入阐明肌肉抑制素的作用机制， 研究了重组肌肉抑制素蛋白对鸡胚成肌细胞和小鼠C2C12成肌细胞增殖与分化的作用，
同时制备了肌肉抑制素特异性抗体。 实验结果表明， 重组肌肉抑制素对于成肌细胞的增殖过程具有极强的抑制作用， 主要表现为抑制细胞周期由G1期向S期的过渡，
细胞生长速度显著变慢； 同时重组肌肉抑制素也抑制成肌细胞分化为多核的融合肌管细胞， 抑制肌肉分化标志myogenin和MHC的表达。 由重组蛋白质制备的抗体能够特异性地识别人、
小鼠、 大鼠和鸡肌肉组织的内源肌肉抑制素。 此外， 通过免疫荧光技术还证实， 肌肉抑制素主要定位于胞液中。

关键词 肌肉抑制素； 细胞增殖； 分化； 抗体制备；
细胞定位

在肌肉发生（myogenesis）过程中， 多种肌肉调控因子（myogenic
regulatory factors, MRFs）的时空特异性表达决定着成肌细胞（myoblast）的增殖与分化等重要生物学活动。 肌肉抑制素（myostatin）为近年来发现的骨骼肌特异性抑制因子，
属于TGF-β超家族成员之一， 又名生长分化因子8（growth and differentiation factor 8, GDF8）［1］。 研究发现，
肌肉抑制素基因剔除小鼠以及肌肉抑制素基因突变肉牛的肌肉组织发生肥大与增生， 从而导致其肌肉重量增加2～3倍［1, 2］。 在一些慢性消耗性疾病、 HIV（人免疫缺陷病毒）感染及衰老过程的肌肉组织中的肌肉抑制素表达水平均有不同程度的升高［3～5］。
人们还发现， 通过不同方法（如应用抗体或反义RNA技术）阻断肌肉萎缩模型小鼠（mdx）的内源性肌肉抑制素后， 其肌肉萎缩表型和肌肉功能得到明显改善［6～8］。
这些证据有力地表明肌肉抑制素有抑制肌肉生长与发育的功能。
目前， 人们对肌肉抑制素发挥抑制作用的分子机制仍知之甚少。 已有的研究结果表明， 肌肉抑制素抑制成肌细胞的增殖是通过上调细胞周期素依赖性蛋白激酶CDK2的抑制因子p21来实现的，
从而引起CDK2活性下降， 而影响成视网膜细胞瘤（retinoblastoma， Rb）蛋白的磷酸化状态， 最终抑制细胞周期从G1期转入到S期（DNA合成期）［9］。
同时， 人们也发现肌肉抑制素还具有抑制肌细胞分化的作用。 超表达肌肉抑制素后， 一些肌肉细胞分化的标志分子表达显著下降［10］。
尽管如此， 人们对于作为细胞因子的肌肉抑制素如何通过其受体来影响细胞内信号传导通路， 并进一步导致哪些影响细胞命运的靶基因的改变并不十分了解。 同时，
作为禽类的典型代表， 鸡的肌肉发育有其自身的特点， 并且鸡胚胎成肌细胞也是用来研究肌肉发生常用的实验材料。 因此， 阐明肌肉抑制素对于禽类肌肉生长发育的作用机理，
将有助于人们更深入地理解其生物学功能。
本实验室曾利用原核表达载体在大肠杆菌中成功地表达并纯化了重组肌肉抑制素， 其表达量和纯度都是令人满意的［11］。 在本研究中， 对重组蛋白质的生物学活性进行了鉴定，
分析了其对鸡胚成肌细胞（chicken embryonic myoblast, CEM）和小鼠成肌细胞系C2C12生长与分化的影响。 同时也制备了抗肌肉抑制素抗体，
在不同种属动物的肌肉组织中通过Western印迹法对所制备抗体的亲和力与特异性进行了鉴定， 并且利用免疫荧光方法分析了肌肉抑制素在成肌细胞中的亚细胞定位。

1 材料和方法（Materials and methods）
1.1 材料
重组肌肉抑制素由本室制备， 新西兰雄性大白兔（1～2 kg）由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供， C2C12细胞系由香港科技大学邬振国博士惠赠，
Trizol试剂、 弗氏佐剂购自Invitrogen公司， FITC-羊抗兔IgG、 HRP-羊抗兔IgG等抗体购自Santa Cruz公司， SuperSignal
Chemiluminescent Substrate显色试剂购自PIERCE公司， 同位素［α-32P］ dCTP购自北京亚辉生物工程公司， 随机引物标记试剂盒购自Promega公司，
ULTRAhyb杂交液购自Ambion公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与处理 胚胎期第10天的鸡胚成肌细胞分离自白来航鸡胚的腿肌。 取孵化至第10天的鸡胚， 剪下后肢， 剔除骨与皮肤， 分离肌肉并剪碎。
剪碎的肌肉组织放入生长培养基GM（DMEM含10%胎牛血清、 2%鸡血清、 1%青/链霉素、 0.5%庆大霉素）中于37 ℃温育20 min， 伴随以间歇性摇动。
将上述分散的细胞缓慢通过0.7 μm的筛网滤器后， 离心收集细胞并接种于明胶铺底的培养皿中。 鸡胚成肌细胞接种于培养皿后12～18 h， 更换新鲜培养基，
并以一定浓度的重组肌肉抑制素 (10 mg/L) 继续处理24 h， 同时以相同体积的PBS处理并收获细胞作为对照。 C2C12细胞培养于生长培养基GM（DMEM含10%胎牛血清、
1%青/链霉素）中， 待细胞密度达到50%时， 以重组肌肉抑制素 (10 mg/L) 处理24 h， 同样以PBS处理作为对照。 另外， 取鸡胚成肌细胞细胞长满后，
继续以相同浓度的重组肌肉抑制素蛋白处理72 h， 同样以PBS处理72 h作为对照， 以观察重组肌肉抑制素对于分化过程的影响。
1.2.2 细胞周期分布分析 在GM中培养的鸡胚成肌细胞和C2C12细胞密度达到50%后， 以重组处理24 h， 胰酶消化并重悬于PBS中使细胞密度达到10⁶个/mL。
在4 ℃条件下取1 mL细胞在2 mL甲醇中固定30 min， 并加入0.5 mL二碘化丙锭溶液（50 mg/L， 溶于3.8 mol/L柠檬酸钠溶液）与0.1
mL RNase A (0.5 g/L)于室温作用30 min。 细胞最终重悬于1 mL PBS中，并以流式细胞计数仪分析处于不同细胞周期细胞的分布比例。

1.2.3 肌肉抑制素抗体的制备与纯化 取1月龄雄性新西兰大白兔6只， 免疫前取少量血清通过Western印迹法分析其是否与重组肌肉抑制素具有交叉反应，
取3只背景清晰的兔进行免疫， 其余3只淘汰。 首次采用弗氏完全佐剂按1 mg蛋白/只皮下多点注射， 此后每3周免疫一次采用弗氏不完全佐剂按 0.5
mg蛋白/只皮下多点注射， 采血分离血清通过Western印迹测定抗体效价。 心脏采血， 分离血清， 联合应用正辛酸和硫酸铵分离纯化方法分离血清总IgG。
具体方法如下： 测量血清总体积（原始体积）， 加入2倍原始体积的60 mmol/L醋酸钠（pH 4.0）， 搅拌并调整pH值至4.8， 逐滴加入正辛酸（每10
mL原始体积加入0.75 mL）， 室温搅拌30 min， 5000 g离心10 min， 小心地转移上清液至透析袋中， 用PBS透析过夜。
透析后3000 g离心30 min， 转移上清液至烧杯中， 加入等体积的饱和硫酸铵， 并于4 ℃搅拌过夜后3000 g离心30
min， 弃上清液收集沉淀并溶于原始体积30%～50%的PBS中， 透析过夜。
1.2.4 蛋白质提取与Western印迹分析 细胞和组织按要求处理后用裂解液（10 mmol/L Tris・HCl、 5 mmol/L
EDTA、 50 mmol/L NaCl、 30 mmol/L焦磷酸钠、 50 mmol/L NaF、 100 μmol/L Na3VO4、 1%
Triton X-100、 10 mg/L 白胃素、 10 mg/L 抑肽酶、 1 mmol/L PMSF， pH 7.6）于冰上消化2 h， 15
000 g离心10 min， 分装上清液组分， 测定浓度并冻于－70 ℃。 取30 μg蛋白质上样于12 %的SDS-PAGE， 30 mA电泳至染料到达底部。
按照标准程序将蛋白质转印至PVDF膜上， 用含100 g/L脱脂乳的TBS-T封闭1 h， 1∶2000稀释的一抗（分别为免疫前兔血清IgG和制备的抗肌肉抑制素IgG）室温摇晃作用1
h， TBS-T洗5 min 6次， 1∶2000稀释的HRP标记二抗室温作用1 h， 再次TBS-T洗5 min 6次后， 加SuperSignal
Chemiluminescent Substrate显色1 min， 压片并显影。
1.2.5 细胞免疫荧光 小鼠C2C12细胞培养于含玻片的六孔板中， 使细胞生长并贴附于玻片上， 当细胞至合适密度时， 倒掉培养基，
用PBS洗玻片3次， 2%甲醛摇晃作用3 min固定细胞， 再用含0.5%Triton X-100的PBS（PBS-T）洗10 min 3次， 1∶80稀释的抗肌肉抑制素抗体37
℃温育1 h， PBS-T洗3个10分钟后再用1∶80稀释的FITC-羊抗兔IgG于37 ℃温育1 h， 最后用PBS-T洗3次， 每次10 min，
封片并用荧光显微镜观察拍照。
1.2.6 RNA提取与Northern印迹分析 细胞进行相应处理后， 用PBS洗涤1遍， 吸干全部液体， 直接向培养瓶中加入5 mL
Trizol试剂， 按照Invitrogen公司使用说明书提取细胞总RNA并测定浓度。 将10 μg总RNA于1.2 % 的MOPS琼脂糖凝胶电泳6～8
h后转移到Hybond-N+尼龙膜上并进行紫外交联。 利用ULTRAhyb超敏感杂交液于42 ℃杂交过夜， 具体实验方法见文献［12］。 本实验用于扩增鸡MHC探针的引物序列为：
上游5′-ATG GGG CCG TGC GGG GCG CTG GGC-3′； 下游5′-ATA GGA AGC AGA ATG AGA TGT
GAG-3′， 用于扩增鸡myogenin探针的引物序列为： 上游5′-ATG GAG CTC TTT GAG ACC AAC CCT TAC-3′；
下游5′-TCA GTT TTG GAC CCG CTC CTC TGG GAA C-3′。

2 结果 (Results)
2.1 重组肌肉抑制素抑制鸡成肌细胞增殖
本室利用原核高效表达载体pTrcHisB在大肠杆菌菌株Top10中成功地表达并纯化了C端半长重组肌肉抑制素蛋白［11］。 对重组蛋白质进行生物学活性鉴定是进一步利用其研究肌肉抑制素功能的首要条件。
在本研究中， 选用了比较有代表性的两种成肌细胞来鉴定重组肌肉抑制素的生物学活性， 即鸡胚成肌细胞和小鼠成肌细胞系C2C12。 在细胞生长至50%密度时，
加入10 mg/L的重组肌肉抑制素，细胞继续培养24 h， 同时以PBS进行相同处理作为对照。
结果如图1所示， 重组肌肉抑制素对两种细胞的生长均具有明显的抑制作用， 细胞生长缓慢， 基本处于停滞状态， 而对照组细胞生长正常， 细胞数量显著高于处理组。
为了深入研究重组肌肉抑制素抑制细胞增殖的机制， 我们收获处理24 h的成肌细胞， 通过流式细胞计数分析不同处理组的细胞周期分布规律（图2）。
鸡胚成肌细胞经过重组蛋白质处理后， 处于S期的细胞比例由9.90%下降至1.07%。 C2C12细胞经过重组肌肉抑制素处理后， 处于S期的细胞比例为5.49%，
而对照组则为35.15%。 经过处理的两种细胞G0～G1期的细胞比例均有显著增加， 结果如表1所示。
2.2重组肌肉抑制素抑制鸡成肌细胞分化
当从培养基中去除血清或降低血清浓度后， 成肌细胞可以自发地进入分化阶段， 此时期细胞的显著特征是细胞形态逐渐拉长， 形成同向排列， 细胞之间相互融合，
形成多核的肌管细胞， 同时表达若干分化相关基因［13］。 在培养的鸡胚成肌细胞中加入重组肌肉抑制素后， 继续培养72 h。 与对照组相比， 处理组的细胞不但数量减少而且不能形成融合的肌管细胞［图3(A)、
3(B)］。 除形态学改变以外， 我们分别从鸡胚成肌细胞处理组和对照组细胞中提取了总RNA， 并对控制肌细胞分化的标志分子（myogenin与MHC）进行了Northern印迹分析。

Fig.1 Myostatin inhibits the
proliferation of C2C12 cells and chicken embryonic myoblast (CEM)
（A）The C2C12 cells treated with PBS for 24 h as control. （B）The C2C12
cells treated with recombinant myostatin for 24 h. （C）The CEMs treated with
PBS for 24 h. （D）The CEMs treated with recombinant myostatin for 24 h. （E）The
cell number of C2C12 cells and CEMs before and after 24 h treatment with recombinant
myostatin.

Table 1 Effects of myostatin
on the S phase entry in C2C12 and CEM cell cycle

	PBS	myostatin
C2C12	35.15%	5.49%
CEM	9.90%	1.07%

Fig.2 The cell cycle distribution
analysis of C2C12 and CEMs with or without recombinant myostatin by flow cytometry
(A) The C2C12 cells treated with PBS for 24 h as control. (B) The C2C12
cells treated with recombinant myostatin for 24 h. (C) The CEMs treated with
PBS for 24 h. (D) The CEMs treated with recombinant myostatin for 24 h.

结果显示， 在重组肌肉抑制素处理的肌肉细胞中， myogenin和MHC的表达均明显下调［图3(C)］，
该表达方式为肌肉抑制素抑制肌细胞分化融合成肌管的细胞学现象提供了分子生物学证据。 总之， 以上结果表明， 本实验制备的重组肌肉抑制素具有抑制成肌细胞分化的生物学活性。

2.3 肌肉抑制素抗体制备、 纯化与鉴定
通过家兔制备肌肉抑制素抗体， 为进一步研究肌肉抑制素的组织表达特异性及其功能奠定了必要的基础。 采用弗氏佐剂制备疫苗和皮下多点注射的方式分4次对家兔进行加强免疫，
通过Western印迹检测抗体效价， 所制备的抗体与重组肌肉抑制素蛋白具有极强的亲和力［图4(A), (B)］。 此外1∶2000倍稀释的抗体可以在人、
小鼠和大鼠的肌肉组织中检测出52 kD的特异性条带， 而在鸡的肌肉组织中可以检测出40 kD的阳性信号［图4(C)］， 并且在52 kD上方存在一非特异性条带，
这可能是所制备的多克隆抗体特异性相对较弱的缘故， 但不影响结果的分析。 这一结果表明， 本实验所制备的抗体在人、 小鼠、 大鼠和鸡等种属动物中均可特异性地识别肌肉组织中的肌肉抑制素。

2.4 细胞内肌肉抑制素的亚细胞定位
肌肉抑制素由肌肉细胞分泌， 蛋白质前体经过剪切加工后， 将成熟的C末端蛋白质分泌至细胞外行使其生物学功能。 应用细胞免疫荧光技术和所制备的抗体对培养在生长培养基中的C2C12细胞进行了肌肉抑制素的细胞内定位研究。
本实验以免疫前同一只家兔的血清IgG作为对照， 结果表明C2C12细胞内的肌肉抑制素主要聚集于细胞质中， 而不存在于细胞核（图5）。

Fig.3 Myostatin inhibits myoblasts
differentiation
The full confluence CEMs were employed to spontaneous differentiation. Before
differentiation, the cells were treated with PBS (A) and recombinant myostatin
(B) for another 72 h; (C) After treatment with recombinant myostatin, expression
of the MHC and myogenin in the treated or untreated CEMs was analyzed by Northern
blotting.

Fig.4 Production and identification
of myostatin specific antibody
The recombinant protein was separated with 12% SDS-PAGE and Wes-tern blot
was performed with pre-immune serum (A) and anti-myostatin antibody produced
in this study (B). (C) Specific recognition of endogenous myostatin proteins
extracted from skeletal muscle of human (1), mouse (2), rat (3) and chicken
(4), total proteins (20 μg) were subjected to Western blot analysis with the
anti-myostatin antibody produced in this study.

3 讨论 (Discussion)
近年来， 人们对肌肉发育生物学的研究越来越深入。 它不但可以作为一种模型来帮助人们了解细胞生长、 分化与凋亡的规律， 而且也为发现肌肉萎缩类疾病的致病机理并为最终攻克它带来希望。
肌肉抑制素作为肌肉特异性的负调控因子日益受到人们的重视， 目前肌肉抑制素已经逐渐被人们确立为肌肉萎缩类疾病的一个新的靶标分子， 通过抑制体内肌肉抑制素分子可以改善萎缩肌肉的功能，
同

Fig.5 Study of the cellular
localization of Myostatin
Immunofluorescence assay was performed with pre-immune serum (A) and the
antibody produced in this study (B) in C2C12 cells. The results showed the
Myostatin in C2C12 cells localized predominantly in the cytosol.

时， 也为进一步开发肉食动物的生产性能提供了可能［8］。 因此，
深入研究肌肉抑制素发挥抑制作用的分子机制也就显得尤为重要。
在肌肉发育过程中， 成肌细胞的增殖与分化是两个相对独立而又密切相关的过程。 当生长中的成肌细胞受到外部刺激或相应信号的作用时， 首先要退出细胞周期，
相互接触的细胞发生融合现象， 进而形成多个细胞核的肌管细胞， 同时表达与肌肉分化相关或分化必需的基因。 以上生物学过程是复杂的分子作用的结果， 一直是人们研究细胞生长与分化机制较佳的细胞模型。
我们在大肠杆菌中表达并纯化了C末端半长重组肌肉抑制素， 该重组蛋白质由176个氨基酸组成， 该部分在不同种属之间高度保守， 同源性几乎为100%，
是研究不同种属动物肌肉抑制素功能的理想材料［11］。 本研究证实该重组蛋白质具有抑制鸡成肌细胞增殖的作用， 可使经处理的细胞滞留于G0～ G1期，
无法过度到S期， 从而阻滞了细胞周期的进展。 由于被处理细胞的细胞周期停滞， 正常的细胞分裂无法进行， 重组蛋白处理24小时后， 细胞数量显著低于对照组。
由于肌肉抑制素具有抑制细胞周期的作用， 因此肌肉抑制素基因剔除小鼠表现出肌肉增生的表型［1］。 另外， 通过形态学与分子生物学的方法， 我们还观察到重组肌肉抑制素对肌细胞分化过程的抑制作用。
重组蛋白质处理的鸡胚成肌细胞失去了相互融合为多核肌管细胞的能力， 同时肌细胞分化的标志分子Myogenin和MHC表达水平显著降低。 上述结果表明，
我们所制备的重组肌肉抑制素具有较高的生物学活性， 为进一步深入研究肌肉抑制素分子作用的机理提供了前提条件。 同时， 也证实了肌肉抑制素对于鸡成肌细胞增殖与分化的抑制作用，
这种作用同样是通过阻滞细胞周期和抑制肌肉分化相关标志分子来实现的。 目前， 本实验室正在应用此重组蛋白质高通量地筛选肌肉抑制素的下游靶基因， 并研究受其影响的细胞内信号传导通路。
另外， 具有生物学活性的高纯度重组蛋白质也为进行蛋白质结晶和解析其分子结构打下了基础。
本研究所制备的肌肉抑制素抗体对重组蛋白及肌肉组织内源性肌肉抑制素具有高度的亲和力与特异性， 同时可识别人、 小鼠、 大鼠和鸡等不同种属动物的肌肉抑制素，
可应用于这些种属动物的肌肉抑制素特有表达规律的研究。 我们还发现鸡的肌肉抑制素分子量为40 kD， 小于其他哺乳动物（52 kD）， 这暗示着禽类与哺乳动物相比，
肌肉抑制素蛋白具有不同的剪切加工模式， 这或许也会导致肌肉抑制素在禽类所特有的生物学功能。 另外在体内， 肌肉抑制素由肌肉细胞合成， 加工成熟后分泌至循环系统，
其行使作用的方式是内分泌、 自分泌和旁分泌3种作用形式都存在。 而在体外培养的细胞中， 或许合成的肌肉抑制素也能够分泌到培养基中， 并且我们也曾经做过Western印迹实验对培养基中的肌肉抑制素进行检测，
但是没有检测到信号。 而细胞免疫荧光实验则很好地证明了， 肌肉抑制素作为一种分泌到细胞外行使功能的细胞因子， 其在胞液内合成并无法进入到细胞核， 这或许暗示了肌肉抑制素并不参与转录调控的过程。
通过以上研究可以证明， 我们所制备的肌肉抑制素抗体可应用于Western印迹、 免疫荧光、 免疫组化等实验检测手段， 具有广阔的应用领域。 更为重要的是，
制备的抗体可用于建立肌肉抑制素功能缺失的动物模型和细胞模型， 改善肌细胞功能， 为肌肉萎缩类疾病的治疗提供了可能的途径。
本文报道的高活性重组肌肉抑制素及其抗体， 为研究肌肉抑制素作用机制包括受体、 信号转导通路和下游靶分子提供了可能。 人们对肌肉抑制素影响肌肉生长发育功能及作用机理的深入了解将在肌肉萎缩类疾病的诊断治疗和高品质肉食动物生产等领域发挥更大的作用。

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Received： August
13, 2003Accepted： September 2, 2003
This work was supported by the grants from the National High Technology Research
and Development Program of China (863 Program) (No. 2001AA222031), and the National
Science Fund for Distinguished Young Scholars of China (No. 300250)
*Corresponding author： Tel, 86-451-86412865; Fax, 86-451-86412865; e-mail, [email protected]

Updated
at: 12-18-2003