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Short Communication
Purification
and Identification of Human Recombinant IFN-β
Expressed in Yeast Pichia pastoris
YU Qi-Wen, LI
Ning-Li, NIE Hong, MA An-Lun, XI Bo1, GONG Yi2, ZHANG Dong-Qing*
( Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Second Medical University,
Shanghai 200025, China;
1Best Gold Genetech. Co. Ltd., Dalian 116001, China; 2Research Center of
Biotechnology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 200233, China)
Abstract
To find an effective and quick way of purifying and identifying recombinant
human IFN-β (rhIFN-β) expressed in yeast Pichia pastoris, Blue Sepharose
6 fast flow (Blue S6FF) and immunological affinity chromatography (IAC)
were compared in this report. rhIFN-β was produced in 15 liter bioreactor
and purified using the two methods mentioned above. The protein concentrations
of rhIFN-β and residual mouse IgG in purified rhIFN-β were determined with
ELISA. The molecular weight and specificity were demonstrated by PAGE and
Western blot. The density of the specific precipitation bands was determined
by gel scanning. The relative bioactivities were determined by cyto pathogenic
effect inhibition (CPEI). The results showed that 2.65 and 3.03 mg of rhIFN-β
were obtained, respectively, by purifying with Blue S6FF or IAC from 2 liter
of fermentation supernatant. The molecular weight was 22 kD. The concentrations
of the special precipitation of rhIFN-β were 95.1% and 96.2% respectively.
The relative bioactivity of rhIFN-β purified by Blue S6FF and IAC were 1.63×107
IU/mg and 1.43×107 IU/mg, respectively. The residual mouse IgG in purified
rhIFN-β by IAC was less than 50 μg/L. The results indicated that rhIFN-β
could be purified effectively and quickly from fermentation supernatant
of yeast Pichia pastoris by IAC. The rhIFN-β products purified by Blue S6FF
and IAC had almost the same purity and bioactivity. The data accumulated
from the experiment are useful to the preparation of rhIFN-β on a larger
scale.
Key words
rhIFN-β; affinity chromatography； yeast； ELISA； cytopathic effect inhibition
重组人β-干扰素的表达、
纯化与鉴定
余奇文 李宁丽 聂红 马安伦 席波 1龚毅 2张冬青*
（ 上海第二医科大学上海市免疫学研究所， 上海200025; 1大连金威基因技术有限公司， 大连116001；
2中国科学院上海生命科学研究院生物工程研究中心， 上海 200233 ）
摘要 经15 L发酵罐制备重组人β-干扰素(recombinant
human IFN-β, rhIFN-β)。 以免疫亲和层析方法纯化发酵液中rhIFN-β并与蓝谱亲和层析纯化法比较， 探索快速高效纯化rhIFN-β的方法。
以ELISA测定rhIFN-β含量及经免疫亲和层析纯化的rhIFN-β中鼠IgG残留量； 以PAGE法鉴定rhIFN-β的分子量； 以CPEI法测定rhIFN-β的生物活性。
取2 L发酵液经免疫亲和层析纯化后， 得到3.03 mg rhIFN-β； 经蓝谱亲和层析纯化后， 得到2.65 mg； 分子量为22 kD；
沉淀带灰度值分别为96.2 %和95.1 %； CPEI比活性分别为1.43×107 IU/mg 和1.63×107
IU/mg； 经免疫亲和层析后纯化物中鼠IgG残留量小于50 μg/L。 实验结果表明， 所采用的免疫亲和层析和蓝谱亲和层析均可快速高效地从酵母菌发酵上清液中分离纯化rhIFN-β基因产物。
关键词 重组人β-干扰素；
亲和层析； 酵母菌； 酶联免疫吸附试验； 细胞病变抑制
β-干扰素(interferon-β，
IFN-β)是由成纤维细胞或巨噬细胞受病毒感染或诱生剂诱导产生的细胞因子， 具有抗病毒、 免疫调节及抗增殖作用［1，2］。 通过表达的重组人β-干扰素（recombinant
human IFN-β, rhIFN-β）， 已应用于多发性硬化的临床治疗［3］。 SARS流行期间， 重组人IFN-α-2b已获准进入临床试验，
用于防治SARS［4］。 鉴于rhIFN-β同样具有抗病毒效应， 并具有独特的免疫调节作用， 可望作为预防与治疗重症急性呼吸综合症(SARS)的重要药物之一。
由于E.coli表达的rhIFN-β缺乏糖基化修饰过程， 导致其生物活性受到一定的影响［5］。 本文报道了以酵母菌作为工程菌， 发酵表达糖基化的rhIFN-β，
以交联抗rhIFN-β单克隆抗体的免疫亲和层析柱纯化发酵上清液中的rhIFN-β， 并与蓝谱亲和层析（Blue Sepharose 6 fast
flow, Blue S6FF）方法比较。 采用ELISA方法、 Western 印迹方法、 细胞病变抑制（cytopathic effect
inhibition， CPEI）等方法鉴定纯化的rhIFN-β， 为产业化制备rhIFN-β基因工程蛋白质积累了实验数据。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
rhIFN-β表达载体1pPICZaIFNS1-X33由上海市免疫学研究所构建； 酵母菌（yeast Pichia pastoris），
上海市免疫学研究所保种； 硫酸铵(AR级)， 上海试剂四厂； Blue S6FF及溴化氰活化的Sepharose 4B， Pharmacia Biotech产品；
rhIFN-β标准品（Avonex）， Biogen公司； 人血清白蛋白， 上海生物制品研究所制品； 羊抗鼠IgG抗体和酶标羊抗鼠IgG抗体，
华美生物技术工程公司； 鼠IgG标准品、 蛋白酶抑制剂， Sigma公司； rhIFN-β发酵液， 采用 B.BRAUN公司15 L发酵罐对稳定表达rhIFN-β的酵母菌经70
h发酵后获得； RPMI1640培养基， Gibco BRL公司产品； 三株抗不同抗原决定簇的rhIFN-β单克隆抗体， 上海市免疫学研究所制备，
经ELISA竞争抑制等方法鉴定［6］。
1.2 酵母菌发酵液的盐析
于发酵液中加入硫酸铵， 使硫酸铵浓度达到25%饱和度， 4 ℃静止3 h， 离心10 000 r/min， 30 min， 去沉淀物。 于上清液中加入硫酸铵，
使之达到55%饱和度， 4 ℃静止过夜， 次日离心10 000 r/min， 30 min， 去上清液， 沉淀物用含15%甘油、 含蛋白酶抑制剂、
0.15 mol/L NaCl、 50 mmol/L pH 6.0磷酸钾缓冲液溶解， 并对同一缓冲液透析， 去除铵离子， 低温保存以备进一步纯化。
1.3 免疫亲和层析
按活化的Sepharose 4B说明书及参考文献［7］操作， 把本所自制的3株抗不同抗原位点的抗IFN-β单克隆抗体共20 mg与活化的Sepharose
4B偶联， 填装至内径2.5 cm， 柱长10 cm的层析柱， 柱平衡以后， 取经硫酸铵粗制的IFN-β溶液上样， 上样量50 ml， 流速1
ml/min， 流出液反复上样二次， 然后连接至Pharmacia公司的蛋白质纯化系统， 用含15%甘油、 0.15 mol/L NaCl的50
mmol/L、 pH 6.0磷酸钾缓冲液洗柱至基线为零， 然后改用目的蛋白洗脱缓冲液洗柱。 收集于试管内， 每管收集4 ml。 收集波长为280
nm紫外峰值蛋白质溶液， 装于透析袋内， 置含15%甘油、 0.15 mol/L NaCl的50 mmol/L、 pH 6.0磷酸钾缓冲液内透析，
透析后用PEG 20000浓缩至5 ml备鉴定。
1.4 蓝谱(Blue S6FF)层析
按蓝谱层析柱说明书操作。 柱内直径×长为2.5 cm×10 cm， 连接至Pharmacia公司的蛋白质纯化系统。 用含15%甘油、 0.15
mol/L NaCl的50 mmol/L、 pH 6.0磷酸钾缓冲液平衡层析柱。 取2 L发酵液， 用2 mol/L NaOH调节pH达到pH
7.2后上样， 流速为3 ml/min， 流出液重复上样二次， 然后用含15%甘油、 1 mol/L NaCl的20 mmol/L、 pH 6.0磷酸钠缓冲液洗柱至基线稳定，
然后改用含2 mol/L NaCl的20 mmol/L、 pH 6.0磷酸钠缓冲液洗柱， 基线稳定后， 再改用50%乙酰乙二醇洗脱IFN-β，
收集于预加有2 ml 基础洗脱缓冲液的试管内， 每管收集4 ml。 收集波长为280 nm紫外峰值蛋白质， 装于透析袋内， 置基础洗脱缓冲液内透析，
透析后用PEG 20000浓缩至5 ml备鉴定。
1.5 rhIFN-β蛋白定量
采用Lowry法对发酵液进行蛋白质定量。 采用间接ELISA方法对IFN-β定量， 取IFN-β标准品， 用碳酸包被缓冲液自5 mg/L起作对倍递减稀释，
建立标准曲线， 并与经碳酸包被缓冲液稀释的样品各100 μl分别加至96孔酶标板内， 4 ℃温育16 h， 然后加含有10 g/L BSA的PBS于室温中封闭2
h， 加入抗IFN-β单克隆抗体作为一抗， 每孔加入100 μl， 37 ℃温育1.5 h， 洗板3次后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，
每孔加入100 μl， 37 ℃温育1 h。 洗板3次后以OPD显色， 显色后以2 mol/L H2SO4终止反应， 在Kinetic Microplate
Reader仪上读取A490值。
1.6 rhIFN-β分子量、 抗原性及纯度鉴定
采用Bio-Rad mini-PAGE电泳系统以还原型SDS-PAGE方法对纯化样品进行分子量测定， 上样量为20 μl (0.8 g/L)，
考马斯亮蓝R-250染色后以凝胶分析仪（UVP）进行灰度扫描， 测定沉淀带灰度值。 SDS-PAGE电泳后， 转移至硝酸纤维素膜上， 分别加抗IFN-β单克隆抗体作为一抗，
HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗， DAB显色后观察抗原抗体反应的特异性。
1.7 rhIFN-β中IgG残留量测定
采用夹心ELISA方法， 以羊抗鼠IgG抗体包被酶标板， HRP标记的羊抗鼠IgG抗体作为检测抗体， 小鼠IgG标准品自800 μg/L起倍比稀释至3.1
μg/L， 建立标准曲线， 检测免疫亲和层析过程中抗IFN-β单克隆抗体的脱落状况。
1.8 IFN-β的比活性测定
采用CPEI方法， 将待检样品与不同稀释度的标准品分别加入96孔平底培养板中， 每孔加入4×105个 Wish细胞， 对照孔不加， 同时每孔加50
μl 经预滴定的VSV病毒。 置50 ml/L CO2， 37 ℃培养箱培养48 h， 显微镜下观察细胞病变情况， 有阳性病变后， 弃上清液，
加入结晶紫染液染色5 min， 用流水冲洗后， 每孔加70%乙醇150 μl， 读取A600值。
2 结果（Results）
2.1 酵母蛋白质的发酵表达
采用不同pH的发酵培养液， 对载有可表达rhIFN-β质粒的酵母菌发酵86 h， 结果显示， 酵母菌在pH 3的发酵培养液中可表达rhIFN-β，
当发酵至70 h时， rhIFN-β表达量达最高峰， rhIFN-β浓度为2.4 mg/L， 随后rhIFN-β浓度逐渐下降（图1）。 在pH>3的发酵培养液中，
有蛋白质丢失现象。
Fig.1 Effect
of fermentation time and pH on rhIFN-β expression
Table 1 Comparison of protein concentration before and after purification
of rhIFN-β
| Item | Fermentation fluid |
Blue Sepharose 6 fast flow |
Salt fractionation |
Immune affinity chromatography |
| Protein concentration ( g/L ) |
1.5 | 0.582 | 1.37 | 0.638 |
| rhIFN-β concentration (mg/L) | 2.4 | 530 | 38 | 606 |
| Volume (ml) | 2000×2 | 5 | 50 | 5 |
| Recovery (%) | 55.2 | 81.1 | 63.1 |
2.2 rhIFN-β的纯化
2 L发酵上清液经蓝谱亲和层析纯化后， 得到rhIFN-β共2.65 mg， 回收率为55.2%。 2 L发酵上清液经硫酸铵粗制及免疫亲和层析纯化后，
得到rhIFN-β共3.03 mg， 回收率为63.1%（表1）。 说明免疫亲和层析方法纯化rhIFN-β比蓝谱亲和层析得率高。 蓝谱亲和层析及免疫亲和层析rhIFN-β洗脱紫外谱见图2。
Fig.2 Purification
of rhIFN-β with Blue S6FF and immune affinity chromatography
2.3 rhIFN-β分子量，
抗原性及纯度鉴定
SDS-PAGE电泳显示（图3）， 我们纯化得到的rhIFN-β分子量约为22 kD。 而IFN-β标准品中因含有白蛋白保护剂， 所以显示有多条杂带。
对染色带灰度扫描， 免疫亲和层析方法获得的rhIFN-β沉淀带灰度百分值为96.52%±23.62%， 高于蓝谱亲和层析方法rhIFN-β沉淀带灰度百分值（95.13%±26.41%），
但无显著差异（P>0.05）。 Western 印迹结果显示， 呈现仅一条抗原抗体结合的染色带， 在22 kD处， 说明纯化物可与相应抗体特异性反应。
Fig.3 SDS-PAGE
electrophoresis
M, marker; 1, purified rhIFN-β； 2, standard IFN-β.
2.4 rhIFN-β的生物活性
采用CPEI方法测定rhIFN-β活性， 采用ELISA测定rhIFN-β浓度， 两结果呈正相关（r=0.89）。 rhIFN-β发酵液经纯化后，
rhIFN-β浓度及CPEI活性分别增加200倍以上。 以蓝谱亲和层析方法纯化得到的rhIFN-β的比活性为1.63×107
IU/mg， 高于盐析+免疫亲和层析方法（1.43×107 IU/mg）， 但无显著差异（P>0.05）。
2.5 免疫亲和层析纯化物中鼠IgG的残留量测定
采用夹心ELISA方法测定经免疫亲和层析纯化的rhIFN-β， 纯化物中鼠IgG的残留量为16 μg/L， 低于国家药检标准（国家药检标准为50
μg/L）。
3 讨论（Discussion）
IFN-β属I型干扰素， 具有很强的抗病毒作用， 更具有独特的免疫调节作用。 IFN-β能上调TH2细胞功能并抑制TH1细胞分泌炎症性细胞因子，
从而达到抑制免疫炎症反应［8］。 IFN-β还具有抑制组织纤维化过程， 通过调节CCR5、 MIP-1α等趋化因子的分泌而抑制炎症细胞侵入病灶区［9,10］。
国外， rhIFN-β已作为专利产品， 应用于治疗多发性硬化症等免疫性疾病， 并有信息表明其还具有抑制SARS病毒感染的作用。
我们用酵母发酵制备的糖基化rhIFN-β。 分别以蓝谱亲和层析和免疫亲和层析纯化发酵液中的rhIFN-β。 蓝谱亲和层析具有高流速特性， 且其分子结构中无生物活性分子脱落现象，
适用于对大容量以及以IFN蛋白为主要成分的分离物的提取［11］。 在pH 7.2、 含1～2 mol/L NaCl的PBS中， 约95%的IFN结合于蓝谱上，
而其他蛋白质组分可通过洗脱液予以洗脱。 我们采用蓝谱亲和层析， 在短时间内， 直接将2 L含rhIFN-β的酵母发酵液进行层析分离， 实验结果显示，
rhIFN-β的纯度及比活性可与Biogen产品媲美。 我们同时采用硫酸铵在酸性条件下对发酵液进行盐析粗制， 沉淀物复溶时加入蛋白酶抑制剂， 通过透析使粗制品的pH回复至pH
7.2， 然后用交联抗rhIFN-β单克隆抗体的Sepharose 4B免疫亲和层析柱对粗制品进行精细分离， 纯化物经PAGE测定， 分子量为22
kD， 与Avonex标准品一致。 Western 印迹染色条带的灰度值为95%以上。 免疫亲和纯析的分离物经ELISA检测， 鼠IgG残留量低于50
μg/L， 符合临床应用的要求。
两种纯化方法比较， 免疫亲和层析纯化得到的目的蛋白免疫特异性好， 且回收率高等优点， 然而， 受免疫亲和层析流速的限制， 必须对发酵液先作硫酸铵盐析，
延长了实验时间， 增加了污染机会， 由此造成比活性减低。 免疫亲和层析还须制备高特异性、 高亲和力的rhIFN-β单抗， 并确保单抗与活化的Sephrose
4B牢固结合。 本实验条件下的蓝谱亲和层析得率及免疫纯度虽然低于硫酸铵盐析+免疫亲和层析方法， 但是， 可快速地对大量样品进行纯化， 适用于产业化制备，
且不需要抗rhIFN-β单抗。 在rhIFN-β发酵过程中， 要求发酵液的pH维持在3， 当pH大于4时， 发酵过程中死亡的酵母菌所释放的蛋白酶可对rhIFN-β的产生酶解作用，
导致rhIFN-β总含量下降（图1）。 蓝谱亲和层析要求预先把发酵液的pH校正到7.2， 在校正中， 可加入蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂， 预防死亡酵母释放的酶对rhIFN-β的酶解作用。
此外， 通过优化发酵条件， 降低酵母死亡率及细胞自溶所释放的蛋白质污染， 可以提高蓝谱亲和层析的得率及免疫纯度。 有关研究正在进行之中。
生物制剂的定量必须综合蛋白质定量和活性单位测定。 采用ELISA 方法检测rhIFN-β， 具有高灵敏度， 检测极限量达到ng/L水平。 采用CPEI方法测定rhIFN-β活性，
经与ELISA结果比较， 两者间呈正相关。 我们认为， 在我国尚无考核rhIFN-β生物活性的统一标准之时， 以ELISA 方法结合CPEI方法可作为考核rhIFN-β生物活性的常规方法。
本方法的建立为大量制备rhIFN-β提供了有用的实验数据。
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Received：
May 29， 2003Accepted： August 21， 2003
The work was supported by grants from the Ministry of the National Science
and Technology in China ( No. 02C26222120033 ) and Shanghai Science and
Technology Committee ( No. 03dz19108 )
*Corresponding author: Tel， 86-21-64453149； Fax, 86-21-64453049； e-mail,
Dongqing13@sh163. net
Updated
at: 12-18-2003