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Construction
of N-LMP1 Transgenic Mice with the Specific Regulation Region in Nasopharynx
ZHANG
Ling1, LAN Ke1, FENG Xiang-Ling1, QIAO Gui-Lin2,
SHEN Xin-Ming2, SHI Yi-Min2, LI Hong1, YAO Kai-Tai1,2*
( 1Cancer Research Institute, Xiangya
Medical School of Central South University, Changsha 410078, China; 2Department
of Pathology, First Military Medical University, Guangzhou 510515, China )
Abstract In
order to elucidate the role of EBV-LMP1 in the nasopharyngeal carcinogenesis,
the expression vector was constructed with subjecting the N-LMP1 gene to double
regulation of two specific regulators: EDL-2 and PLUNC-p. The N-LMP1 related
transgenic mice model has been constructed successfully by pronucleus
microinjection. 58 founder mice were born, 4 of which were founded to be
positive by PCR and Southern blot. Immunohistochemistry assay showed that
N-LMP1 protein was expressed in the nasopharynx, tongue and forestomach of
transgenic mice.
Key
words tissue-relative-specific
promoter; N-LMP1; transgenic mice
______________________________________________
Received:
July 15, 2003 Accepted:
September 28, 2003
This
work was supported by the grants from the National Nature Science Foundation of
China (Key Program) (No. 39730200), the National Natural Science Foundation of
China (No. 39970306) and the Major State Basic Research Development Program of
China (973 Program) (No. G1998051201)
*Corresponding
author: Tel, 86-731-4805451; Fax, 86-731-4360094; e-mail, [email protected]
用鼻咽相对特异性调控区建立N-LMP1转基因小鼠
张玲1 蓝轲1 冯湘玲1 乔贵林2 沈新民2 石益民2 李虹1 姚开泰1,
2*
( 1中南大学湘雅医学院肿瘤研究所, 长沙
410078; 2第一军医大学病理教研室, 广州 510515 )
摘要 为了研究EBV-LMP1在鼻咽癌发生发展中的作用,
构建了EDL-2、 PLUNC-p双启动子调控鼻咽癌来源的LMP1(latent
membrane protein 1, 潜伏膜蛋白1)的表达载体, 采用受精卵前核显微注射法构建转基因小鼠。
结果表明, 在所获得的58只转基因首建鼠中,
4只整合阳性, 其中的一只转基因小鼠在鼻咽、 前胃、 舌根等部位检测到了外源基因的表达。
关键词 组织相对特异性调控区; N-LMP1; 转基因小鼠
临床资料和流行病学研究表明EBV与鼻咽癌高度相关, 但由于缺乏实验动物学方面的证据, EBV在鼻咽癌发生发展过程中究竟扮演怎样的角色一直是争论的热点。 虽然针对EBV中已确定的瘤蛋白LMP1(latent membrane protein 1, 潜伏膜蛋白1)的转基因动物模型已做了多次尝试, 如分别用免疫球蛋白重链基因的启动区、 MT-1启动子、 逆转录病毒的LTR等与LMP1基因组成表达载体导入小鼠体内, 但均没有在鼻咽组织中成功实现转入基因的表达[1～5]。 原因可能是所用的调控区不足以调控外源基因在鼻咽部的表达。 为了解决这一问题,
本实验室克隆了鼠鼻咽相对特异性表达基因（PLUNC）的启动子（PLUNC-p）[6]。
体外证实其调控活性在上皮细胞中明显高于成纤维细胞, 转基因爪蟾实验亦表明PLUNC-p启动绿色荧光蛋白（GFP）局限性表达于部分皮肤及鳃弓等部位[7]。
同时, 现有的研究已经证实在EBV-BNLF基因的下游,
就存在一具有角质细胞特异性调控活性的启动子EDL-2[8]。
鼻咽上皮由假复层纤毛柱状上皮、 过渡上皮、 复层鳞状上皮等多种上皮组成, 本研究构建双启动子（鼠鼻咽相对特异性表达基因PLUNC的启动子PLUNC-p、
上皮细胞特异性启动子EDL-2）调控鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1基因（N-LMP1）的真核表达载体, 以期提高转基因的靶向性,
建立N-LMP1在鼻咽表达的转基因小鼠模型。
1 材料和方法
(Materials and Methods)
1.1 材料
清洁级昆明小白鼠由第一军医大学动物中心提供; 人永生化表皮细胞HaCAT购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。 含鼻咽癌来源的LMP1基因（N-LMP1）的质粒J124A8-CAOLMP1由瑞典卡路林斯卡研究所Hu LF教授惠赠;
逆转录病毒表达载体pLXSN, 由美国匹兹堡大学Ahearn博士赠送;
EDL-2启动子由PCR扩增带有EDL-2启动子的质粒pZipNeoSV-LMP1获得, 其中上游引物是:
5′-CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA-3′, 下游引物是:
5′-GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA-3′, 分别在上游引物5′端引入EcoRI位点,
下游引物5′端引入BamHI位点。 LMP1抗体购自DaKo公司。
1.2 组织特异性表达载体的构建
AatII酶切去除pLXSN载体（图1）中5′端LTR启动子,
在多克隆位点处通过EcoRI和BamHI酶切定向插入EDL-2启动子, 在EDL-2上游通过EcoRI非定向酶切插入PLUNC-p启动子, 在EDL-2下游以BamHI非定向酶切插入N-LMP1基因。 XbaI酶切鉴定片段插入正反方向。
选取含有正向插入的表达载体阳性克隆, 用Qiagen plasmid midi purification kit抽提纯化质粒, 用于细胞转染及显微注射实验。
Fig.1 Original plasmid map
1.3 转基因载体的体外表达分析
按LipofectAMINE说明书进行, 脂质体包裹N-LMP1表达质粒DNA（约2
μg）, 转染人永生化上皮细胞系HaCat,
48 h后, G418筛选稳定表达克隆,抽提细胞RNA（按Trizol说明书进行）,
RT-PCR检测基因mRNA水平的表达。 所用的引物序列: 5′-CACCCTCCTACTCATCGCTC-3′, 5′-AGTCATCGTG-GTGGTGTTCA-3′。
反应条件: 94 ℃、 1 min; 94 ℃、
40 s, 60 ℃、 40 s, 72 ℃、 40 s, 35 个循环;
72 ℃、 10 min。
扩增片段大小为327 bp。
1.4 受精卵前核显微注射建立转基因动物模型
1.4.1 溶液及培养液的制备 将含双启动子的表达质粒pPLUNC-p-EDL-2-LMP1用ScaI酶切线性化后凝胶电泳,
胶回收试剂盒回收酶切片段（10.2 kb）, 溶于TE（10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA, pH
7.5）中, 浓度为4 mg/L, 0.22 μm的滤器过滤,
5 μL/管分装, －20
℃冻存备用。
1.4.2 实验动物的准备 选择体重18～20
g的健康成年雌鼠, 在进入暗周期前4～5
h, 注射5 IU PMSG, 48 h后注射5 IU HCG, 与单笼饲养的正常健康雄鼠交配, 次日晨检查阴栓, 处死, 采集受精卵。 同时, 从母鼠中挑选外阴部潮红的个体, 和上述超排鼠同步, 与单笼饲养的结扎雄鼠放在一起, 次日选择有阴栓者作为移植的受体。
1.4.3 注射与移植将受精卵移入M2培养液中,
置于显微注射仪的载物平台上注射, 注射后的受精卵在体外M16中培养20～30 min后,
选择形态好的注射受精卵用于移植。
1.5 转基因鼠外源基因的检测
1.5.1 PCR检测外源基因的整合仔鼠生长至21天,
剪鼠尾抽提DNA, PCR扩增N-LMP1基因。 所用的引物序列与RT-PCR中的引物相同（5′-CACCCTCCTACTCATCGCTC-3′; 5′-AGTCATCGTGGTGGTGTTCA-3′)。 反应条件: 94 ℃、
1 min; 94 ℃、 40 s, 60 ℃、 40 s, 72 ℃、
40 s, 35 个循环; 72 ℃、 10 min。 PCR扩增产物大小404 bp（包括N-LMP1基因内含子77
bp）。
1.5.2 Southern 印迹检测N-LMP1的整合鼠尾基因组DNA约20 μg,
BamHI酶切, 毛细管虹吸法转移至尼龙膜。 N-LMP1基因 PCR扩增产物纯化后,
用地高辛标记试剂盒进行探针标记, 与尼龙膜进行杂交, 严格洗膜后,
地高辛检测试剂盒进行显色反应。 由于BamHI可切下载体中3.6 kb N-LMP1基因, 如有基因整合可检测到3.6
kb的阳性信号。
1.5.3 免疫组化检测N-LMP1基因在转基因小鼠不同组织中的表达Southern阳性转基因鼠颈椎脱臼处死, 分离鼻咽、 气管、 食道、 膀胱、 前胃、 小肠、 舌、
肝等组织, 10%甲醛固定, 常规石蜡制片。 免疫组化检测按照UltraSensitive S-P kit说明书操作。
2 结果(Results)
2.1 表达载体的构建
逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点处通过定向／非定向连接, 插入启动子PLUNC-p, EDL-2以及外源基因N-LMP1, XbaI酶切鉴定重组子的正反方向（图2）。 N-LMP1基因正向插入可获得5.2
kb/5.0 kb 两个片段, 反向插入获得5.7 kb/4.5 kb 片段。
Fig.2 Identification of recombinant
vector pPLUNC-p-EDL2-N-LMP1 with XbaI
1,2,4
and 7, forward recombinant (5.2 kb + 5.0 kb); 5 and 6, reverse recombinant (5.7
kb + 4.5 kb); M, marker.
2.2 体外细胞转染, 鉴定表达载体
选择含有正向插入片段的表达质粒大规模抽提纯化, 脂质体介导转染人永生化上皮细胞HaCat, 挑选单克隆扩大培养, 抽提RNA, RT-PCR检测N-LMP1基因转录水平的表达情况, 结果显示所选的6个转染细胞克隆有PCR扩增产物327
bp, 证实N-LMP1基因的表达载体成功构建(图3)。
Fig.3 RT-PCR analysis for N-LMP1 gene
expression in the HaCat cell lines
M,
DNA marker; 1, N-LMP1 amplification from gDNA, 404 bp; 2－7,
RT-PCR of N-LMP1 expression 327 bp.
2.3 转基因鼠N-LMP1基因整合的检测
PLUNC-p和EDL-2双调控N-LMP1基因的表达质粒体外细胞转染鉴定后, ScaI或PvuI 酶切线形化,用胶回收试剂盒纯化10.2
kb片段, 稀释成4 mg/L, 抽滤后用于受精卵前核显微注射。
共注射1450枚受精卵, 移入62只受体鼠, 其中22只妊娠, 产仔58只, 所有首建鼠未观察到生长或表型异常。
21天后, 剪仔鼠尾, 抽提DNA,
PCR检测基因的整合, 其中15只转基因鼠检测到404
bp的扩增产物, 为PCR阳性（图4）, Southern印迹进一步在其中4只转基因小鼠中检测到3.6
kb BamHI酶切产物信号, 证实为整合阳性, 阳性率为7%（图5）。
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Fig.4 Genomic M, |
Fig.5 Southern 1－7, |
2.4 转基因鼠N-LMP1基因表达的检测
随机选一只雌性整合阳性首建鼠颈椎脱臼处死, 取鼻咽、 气管、 食道、 肺、
舌、 前胃、 小肠、 肝等不同组织, 免疫组化检测LMP1蛋白的表达。 结果显示: 仅在转基因鼠的鼻咽鳞状和柱状上皮、
舌根、 前胃等部位检测到LMP1的表达(图6)。
Fig.6 Immunohistochemical detection of
N-LMP1 expression in different tissues of nasopharynx of transgenic mouse
(A)
Squamous cells (400×).
(B) Pseudostratified columnar epithelium cells (400×).
(C) Forestomach (400×).
(D) Tongue (200×).
3 讨论（Discussion）
潜伏膜蛋白1由EBV基因组BNLF-1基因编码, 能在体外转化B淋巴细胞和啮齿类成纤维细胞, 诱导细胞增殖,
抑制上皮细胞终末分化和凋亡, 是EBV基因组编码并在鼻咽癌组织中表达的与细胞转化有关的少数几个蛋白质之一, 在EBV致癌过程中起重要的作用[9,10]。 现已建立的EBV相关转基因动物模型主要以LMP1为研究对象。 LMP1转基因小鼠可诱发B淋巴细胞瘤[11], 但未见鼻咽癌发生的报道,
转基因鼠的鼻咽组织中亦未检测到LMP1的表达, 其原因很有可能是所用的启动子未能有效调控外源基因在鼻咽组织中的表达。 本研究选用可调控基因在鼻咽组织表达的相对特异性启动子, 希望其能调控LMP1基因高效并相对特异性表达于转基因鼠鼻咽, 在此基础上观察鼻咽组织的病理变化。
近来Chen等及其他研究者[12～14]发现在中国大陆和台湾地区的鼻咽癌组织中分离的N-LMP1基因与B95-8来源的B-LMP1基因的序列存在差异, 主要表现为N-LMP1的第343～352位存在10个氨基酸的缺失;
在N-LMP1的C端11个氨基酸重复数量多于B-LMP1; N-LMP1胞内N端区和跨膜区有较多氨基酸替代变异, 特别是在第13位氨基酸的变异导致一个XhoI酶切位点的丢失。 功能研究表明N-LMP1比B-LMP1更具恶性转化活性。 本研究中采用鼻咽癌来源的N-LMP1基因作为目的基因, 希望有可能增加鼻咽上皮细胞的恶性转化。
PLUNC 基因由Weston等[15]通过差异展示技术（differential
display）在小鼠中克隆, 局限表达于软腭、 鼻咽、 肺等组织,
进一步研究表明其特异性表达于柱状上皮。 本实验室何志巍等[16]采用微阵列膜技术在人鼻咽组织中克隆到了其同源基因YH1,也具有类似的表达模式。 通过染色体缓移技术,
我们获得了PLUNC的5′端上游847
bp的序列, 命名为PLUNC-p, 并在体外通过荧光素酶报告基因体系证实了其启动子活性。 该启动子在TMNE细胞（化学致癌物二亚硝基哌嗪转化的小鼠鼻咽上皮细胞）中的调控活性明显高于NIH3T3细胞, 在转基因爪蟾中亦调控GFP蛋白局限性表达于部分皮肤和鳃弓等部位[6～7]。 EDL-2启动子存在于EBV-BNLF1基因的下游, Nakagawa等[17]
曾用该启动子与周期蛋白D1 cDNA的融合基因进行转基因小鼠研究, 在转基因小鼠的舌、
食道、 前胃及皮肤等组织中检测到周期蛋白D1的表达, 且多位于基底层或基底上层复鳞上皮。 体外报告基因系统分析也显示特异地在鳞状上皮细胞系TE-11（食道鳞癌细胞系）、
SCC-13（人皮肤鳞癌细胞系）、 SCC-25（舌鳞癌细胞系）中EDL-2有很高的活性,
证实其为鳞状上皮特异性启动子[18]。
由于PLUNC-p、 EDL-2等启动子尚可调控基因在鼻咽以外的组织中表达, 故称之为鼻咽相对特异性启动子。
考虑到鼻咽上皮是由假复层纤毛柱状上皮、 过渡上皮和复层鳞状上皮组成, 同时使用PLUNC-p、 EDL-2上皮特异性调控区,
以期提高转基因的靶向性。
转基因小鼠检测结果表明在所获得的58只首建转基因小鼠中, 15只PCR阳性,
但仅其中4只Southern杂交中检测到阳性信号,
提示PCR有部分假阳性, 分析原因可能在剪鼠尾时存在部分交叉污染。
整合阳性转基因小鼠中, 尚未观察到出现异常表型。 对其中的一只雌性首建鼠进行N-LMP1表达分析, 在鼻咽、 气管、 食道、 肺、
前胃、 小肠、 舌、
肝等组织中, 仅鼻咽、 前胃和舌根组织中检测到N-LMP1的表达。 这一结果说明实验中所选用的启动子成功调控基因定位表达于鼻咽上皮组织。 但是,
可能由于转基因表达时间较短（仅4个月）, 未观察到鼻咽组织明显的病理改变。
此外, 考虑到肿瘤的发生是一个多因素多步骤的过程, 以往的研究虽然提示LMP1与鼻咽癌相关密切,
但在癌变过程中尚需要一些其他致癌因素的协同作用。 本研究的下一步工作将计划在其他尚存活的转基因小鼠中使用TPA、 正丁酸盐等促癌剂, 进一步观察鼠鼻咽组织的病理变化。
______________________________
本研究工作在组织标本的制作及结果判断中得到了第一军医大学病理科丁彦青主任; 李祖国、 蔡俊杰、 张燕同志的帮助。 实验得到了梁丽、 江培洲、 黄华、 何英等研究人员的支持, 在此表示感谢。
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