(03296)Xie ZQ et al.: A Method for Delineation of Domains in Proteins Based on Refolding Free Energy

A
Method for Delineation of Domains in Proteins Based on Refolding Free Energy

――Application
to Continuous and Discontinuous Domains

XIE
Zhi-Qun, XU Gen-Jun*

( Institute of Biochemistry and Cell
Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of
Sciences, Shanghai 200031, China )

Abstract        Domain
is a protein architecture in a subunit. It might be defined as a basic unit for
structure, function, folding, evolution and design. Different combinations of
domains lead to the formation of various tertiary structures with various functions
for proteins. The delineation of domains for a protein is important both
conceptually and practically, which remains up to date a challenging and
unsolved problem. Based on the above definition, a method was previously
proposed based on refolding free energy to define continuous domains in
proteins. By constructing a residue-residue contact matrix, using
correspondence analysis, and then selecting optimal partition function of a
protein according to refolding free energy and some empirical scoring functions,
a new computer program, PDOM, was developed, which was applicable to both
continuous and discontinuous domains. When compared with the manual partition
results reported by crystallographers, PDOM has achieved an accuracy of 76% on
a test data set including 55 protein structures frequently used. The
differences in 13 proteins between PDOM, literature as well as SCOP have been
discussed extensively.

Key
words     protein domain; contact
matrix; free energy; scoring function; identification

________________________________________________

Received:
August 12, 2003    Accepted:
September 17, 2003

This
work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of
China (No. 39930060)

*Corresponding
author: Tel, 86-21-54921257; Fax, 86-21-54921011; e-mail, [email protected]

基于去折叠自由能的蛋白质结构域划分方法

――适用于连续与不连续结构域

谢志群     许根俊*

( 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所, 上海
200031 )

摘要       结构域是蛋白质的一个结构层次, 可以看作是蛋白质结构、 折叠、 功能、 进化和设计的基本单位。 大多数的蛋白质都可分为若干个结构域, 结构域的不同组合使蛋白质具有不同的三级结构并具有不同的功能。 蛋白质结构域的划分在理论与应用上都具有重要意义, 但目前对结构域的划分还没有一个十分理想的方法。
作者曾经发展了一种通过计算去折叠自由能划分蛋白质结构域的方法, 但该方法只适用于连续双结构域的划分。 现在,作者通过构造氨基酸残基相互作用矩阵, 并进行对应分析(correspondence analysis), 然后根据去折叠自由能和一些经验打分函数对蛋白质进行切割和优选, 发展了可以同时处理连续和不连续结构域的划分方法。 该方法与晶体结构作者手工分析相比较, 二者的结果有76%的相似。

关键词   结构域; 作用矩阵; 自由能;
打分函数; 划分

蛋白质肽链从一级结构完全伸展的状态折叠成特定的三级结构, 其折叠模式是复杂的,
很难用一种机制来描述蛋白质三级结构的形成和组织过程。 在开始解析蛋白质结构时,
人们的注意力首先集中于单个蛋白质结构的细节, 而忽略了蛋白质结构之间的联系。 在上个世纪七十年代初,
Wetlaufer[1]分析了仅有的几个蛋白质的晶体结构, 首先提出结构域的概念。 随后Rossmann等[2]指出脱氢酶,
黄素氧还蛋白, 激酶都有核苷结合结构域。 现在人们已经认识到结构域是蛋白质结构中普遍存在的一种结构单位, 是介于二级结构元件和完整蛋白质三级结构之间的一种结构层次。 虽然目前结构域还没有一个被普遍接受的定义, 但通常认为结构域是蛋白质中那些结构紧密且相对独立的单位, 如果没有其他复杂因素的影响, 每个结构域可以与蛋白质其他部分分离, 分离后应仍然能以类似天然的构象独立存在。

结构域可以看作蛋白质结构、
折叠、 功能、 进化和设计的基本单位。 结构域信息对于蛋白质结构解析有重要意义, 对结构域折叠的研究则有助于揭示蛋白质折叠的一些普遍规律。 结构域数据库的建立能够为蛋白质结构、
折叠、 功能、 进化和设计等领域的研究提供重要信息。 目前已经有一些基于结构域的蛋白质结构数据库, 如SCOP[3]和CATH[4]。 这些数据库为蛋白质结构功能分类、 分析、 预测和设计提供了很多方便。 传统上,
研究人员通常通过目测用手工办法来将一个多结构域蛋白质划分为多个独立结构域。 但是PDB数据库中保存的蛋白质数目随着测定出的蛋白质晶体结构数目增多, 以指数速率增加[5], 因此迫切需要一个高效、
可信、 完全自动化的结构域划分方法客观地对结构已知的蛋白质划分结构域。

Jones等[6～10]用55个蛋白质结构对常见的四个结构域划分程序进行了系统评估。 结果发现,
如果以蛋白质结构解析作者确定的结构域作为标准, 四个程序的结构域划分和手工方法划分的符合率在67%～76%之间。 当用四个程序分别对787个蛋白质结构进行结构域划分, 则四个程序的划分结果只有55.7%是一致的。 显然不同的指导思想对于结构域的划分影响是巨大的。 另外,
由于结构域划分的计算机程序还不很完善, 目前构建结构域数据库时通常需要人工干预和检查。 譬如,
SCOP数据库中的所有蛋白质结构域都是专家手工确定的[3]; CATH数据库中的结构域也是用计算机和手工结合方法确定的[4,6]。

划分结构域的核心问题是用什么标准去划定结构域的界限, 而这些标准是否具备足够的合理性。
我们曾经发展了一种通过计算去折叠自由能划分蛋白质连续结构域的方法, 对50个连续双结构域的蛋白质结构进行划分, 得到了比较合理的结果[11]。
我们认为去折叠自由能比较其他的标准更能全面地反映结构域可以看作蛋白质结构、 折叠、 功能、 进化和设计的基本单位的内涵。 为了使这一方法能够应用于任意数目、
连续或不连续结构域的蛋白质系统, 本文对该方法进行了全面改进, 使之成为一个称之为PDOM的完整的结构域划分系统。 基本思想是:
首先构建一个氨基酸残基相互作用矩阵, 然后根据残基相互作用的大小对残基重新排序, 得到一个经过重新排序并能反映残基相互作用关系的残基序列; 然后用以前报道的方法沿着重排序列在不同切点将蛋白质结构划分为两部分结构, 比较不同切点的去折叠自由能并考虑其他影响因素确定一个最佳切点, 得到两部分结构, 用相同的标准,
对每一部分结构尝试进一步的划分, 直到无法继续切分为止。

1    材料和方法(Materials
and Methods)

1.1   材料

我们选用Jones等[6]评估不同计算机划分程序时所采用的55个蛋白质作为结构域划分的对象, 为的是便于进行比较。 55个晶体结构数据都来自于2003年4月的PDB数据库[5]。

1.2   方法

1.2.1       构建氨基酸残基作用矩阵   对于一个蛋白质, 首先计算氨基酸残基之间相互作用, 得到一个N×N的对称作用矩阵,
N为残基数目。 对于蛋白质中第i个残基与第j个残基,
如果原子p, q之间的距离在预先设定的阈值以内, 则认为这两个氨基酸之间存在相互作用, 这个距离的阈值常设为0.4 nm, 采用公式(1)计算氨基酸残基之间相互作用函数Ci, j:

                                               (1)

这里, dp, q为残基i的原子p和残基j的原子q之间距离, 由于库伦作用为距离平方的函数, 而范德华作用则与距离的6次方和12次方有关,
考虑到蛋白质结构数据的精度, 在计算中采用1 / (dp,q ・
dp,q)来计算距离为dp,q 的p,q两原子之间的作用;
bb为对主链原子加权, 当p,q都为主链原子时bb=5,
否则bb=0; pb为对残基的加权, 当两残基i,
j处于肽键两侧时, pb=5×[1.0/(1.33×1.33)]=2.82662,
这个数值相当于取距离为1.33 Å (1 Å=0.1 nm)的两原子间相互作用力的5倍来计算,
蛋白质结构中肽键的平均键长为1.33; ss为对二硫键相互作用加权, 我们取ss=50×[1.0/(2.02×2.02)]=12.2537,
这相当于距离2.02 Å的两原子间作用的50倍,
蛋白质结构中二硫键中两硫原子间距离平均为2.02 Å; hb为对β结构（β-strand）之间的氢键作用加权,
我们取hb=50×[1/(2.8×2.8)]=6.37755,
这相当于距离2.8 Å的两原子间作用的50倍,
蛋白质结构中形成氢键的两个重原子间距离平均为2.8 Å。
这些经验参数的采用我们参考了Holm等[7]和Guo等[12]的工作,
其中β结构之间的氢键形成情况采用DSSP程序计算[13]。

1.2.2       残基序列重排       我们按照Holm和Sander的办法对氨基酸残基作用矩阵进行对应分析[7,14,15], 得到有意义的最大特征值及其相应特征向量, 根据该特征向量将氨基酸残基重新排序, 最后获得一条根据残基相互作用关系重新排序的残基序列[7]。
这个方法已经被Holm和Sander[7]用来对一条包含多个切点的序列进行二分切割, 因此对该方法的细节可以参考Hill[14,15]以及Holm和Sander[7]的工作。

1.2.3       双结构域的划分    通过对应分析获得根据残基相互作用关系重新排列后的残基重排序列, 接下来就可以沿重排序列进行一系列划分切割。 每次划分切割可将蛋白质切点前（包括切点）和切点后的残基分别划分成两个拟定的结构域。

为了强调蛋白质一级结构对蛋白质折叠的重要性, 每次切割都必须满足:
(1) 必须在肽链N端（或C端）10个残基以外; (2) 禁止切割发生在β结构(在β-sheet中),
β折叠必须保持其完整性; (3) Nedwidek等[16]在1997年认为蛋白质结构最少为34个残基,
因此我们在结构域划分中设定结构域至少要包含34个残基。

为了强调结构域是结构紧密的相对独立单位, 每个结构域的结构紧密度c必须大于0.52[12], 同时该结构域对其他结构域的依赖度d必须小于0.56[12], 否则不可切割。 结构紧密度的计算采用Guo等[12]的定义如式(2):

                                                                                             (2)

这里, i, j为序列上相隔至少3个残基的任意两个原子;
如果i和j的距离小于或等于4
Å, Pi, j = 1, 否则Pi, j = 0; na为结构域内的原子数目。 依赖度计算见式(3),
采用与Guo等[12]类似的定义:

                                             (3)

其中分子为结构域与蛋白质其他部分的作用, 分母为结构域内部作用。

为了强调结构域作为相对独立的折叠单位的特征, 我们需要计算结构域的去折叠自由能。
如果一个结构域的去折叠自由能大于零, 则可以认为该结构域从蛋白质中分离后有可能自发折叠为与天然态类似的构象。 结构域去折叠自由能采用经验的结构参数化方法计算[17], 我们以前发表的结构域划分方法中对此有详细描述[11], 其中构象熵的计算作了一些调整, 目前采用公式(4)计算:

             (4)

这里, m为蛋白质中所拟定结构域部分所有残基数, Si, bu-ex为第i个残基侧链从结构域内部转到表面引起的标准构象熵变, Si, ex-u为第i个残基由于骨架去折叠导致侧链构象发生变化而引起的标准构象熵变, Si, bb为第i个残基所属的骨架去折叠引起的标准构象熵变。
Si, bb, Si, ex-u和Si,
bu-ex均采用Luque等[18]发表的数据。
ASAi为第i个残基在折叠态时的溶剂可接触面积, uASAi为第i个残基残基在去折叠态时的溶剂可接触面积。
ASAi采用Lee和Richards[19]算法计算, 其中探针球半径为0.14
nm; uASAi采用Luque等[18]的数据。 ki是一个和第i个残基在溶剂中的暴露程度有关的经验参数, 本文采用式(5)确定。

                                            (5)

划分结构域时不但要考虑结构域的去折叠自由能的大小, 而且要考虑结构域和蛋白质其他部分相互作用的大小, 即结构域对蛋白质其他部分的依赖度, 因为只有依赖度比较小才有可能实现结构域的分离。 另外,
基于蛋白质一级结构对于蛋白质折叠的重要性, 因此当结构域残基数一定时, 其中结构域间交换的肽段（swapping
peptide fragments）数目越多, 结构域自发折叠为类似天然态的构象越困难。 为此我们构造了一个尽可能反映上述复杂情况的打分函数f, 每次二分切割都根据该打分函数计算一个f分数, f分数最高的切割即为最佳划分。 打分函数构造如式(6):

                                              (6)

这里, g1, g2分别为两个结构域的去折叠自由能, 使g1,
g2同时小于零的切割不作考虑; n1, n2分别为两个结构域的残基数; s1, s2分别为两个结构域中的序列上不连续的肽段数; d1, d2分别为两个结构域的依赖度。

数学上,
方程(6)的分母不能为零, 如果出现一个切割使得方程(6)的分母为零, 则可以认为f为无穷大。 由于方程(6)的分母中只有依赖度有可能为零, 因此当在一系列切割中出现依赖度为零的切割后, 则最佳划分只在这些依赖度为零的切割中选择。
此时由于f分数已没有意义, 因此我们需要采用另外一个类似f的打分函数g[公式(7)]来代替f分数:

                                              (7)

然后根据g分数高低对不同切割进行排序, g分数最高的切割点即为最佳结构域的划分处。
如果在这些依赖度为零的切割中出现结构域去折叠自由能小于零的切割, 则最佳划分只在依赖度为零且结构域去折叠自由能大于零的切割中选择。 此时不必再考虑g分数, 而是直接比较结构域的去折叠自由能, 结构域去折叠自由能相对最大的切割点即为结构域的最佳划分处。

1.2.4       多结构域的划分    多结构域（两个以上）的划分与双结构域的划分类似, 只要对已经划分得到的结构域继续进行下一个层次的划分即可。 如果对得到的结构域不断递归(recursion)划分, 就可以划分包含任意数目结构域的蛋白质。 为了避免对蛋白质的无限划分, 我们采用2条规则来对结构域的递归划分进行限制:(1）
由于结构域至少要包含34个残基, 因此残基数小于68的结构域不再继续划分为两个结构域; (2）
如果对一个结构域不断递归划分得到的结构域总数小于2, 则递归划分不再继续进行。

2    结果和讨论(Results
and Discussion)

2.1   结果

由于目前还没有一个普遍接受的结构域划分标准可以用来准确评估不同结构域划分方法的正确性, 采用较多的是晶体结构作者确定的结构域划分, SCOP结构域数据库[3]和CATH结构域数据库[4,6]。 但是在实际工作中, 很多蛋白质晶体结构的作者并没有指出蛋白质中结构域的具体氨基酸残基范围; SCOP数据库则是一个完全由专家手工确定的结构域, 一般认为可信度比较高,
但是该数据库中有很多蛋白质只指出了结构域的数目, 而没有指出结构域的具体残基范围。 Jones等用55个蛋白质结构作为数据集,
对四个结构域划分程序进行了测试, 四个程序的符合率在67%～76%之间。 由于这55个蛋白质都可以找到晶体结构作者确定的结构域, 因此常常用来作为评价结构域的计算机划分方法的一个简单标准。 根据晶体结构作者指出的结构域, 这55个蛋白质中有30个为单结构域,
20个为双结构域, 2个为三结构域, 3个为四结构域。 为了便于比较, 我们也采用这55个蛋白质作为结构域划分对象, 将我们的程序PDOM划分的结构域与晶体结构作者及SCOP数据库的结构域进行比较,
具体结果列于表1。

Table 1   Definitions of domains in 55 proteins

Abbreviations used for column headings in
this table: Protein, protein PDB code with chain identifier; Literature,
comparison between definitions of domains derived from crystallographer and
PDOM; SCOP, comparison between definitions of domains derived from SCOP and
PDOM. Abbreviations used in column Literature and SCOP: A for agreement, N for
disagreement.

为了便于比较,
首先, 我们把PDOM划分结构域的结果纳入Jones等[6]对符合性的评价体系:
第一, 不同程序划分的结构域数目必须一致; 其次, 结构域重叠部分的残基数除以蛋白质肽链的残基总数, 得到的数值必须大于0.85。
结构域符合性定义的详细讨论可以参考Jones等[6]的文章。 如果以晶体结构作者确定的结构域划分作为标准, 我们划分的结果只有13个与其不一致。

对13个与晶体结构作者不一致的蛋白质, PDOM划分的结构域中有3个蛋白质的结构域与SCOP指出的结构域是一致的,
结果列于表2。

Table 2  Comparison between different definitions
of domains in 13 proteins

Abbreviations used for column headings in
this table: Protein, protein PDB code with chain identifier; Literature,
comparison between definitions of domains derived from crystallographer and
PDOM; SCOP, comparison between definitions of domains derived from SCOP and
PDOM. Abbreviations used in column Literature and SCOP: A for agreement, N for
disagreement.

2.2   讨论

对由这55个蛋白质组成的测试数据集, 如果以晶体结构作者确定的结构域划分作为标准, PDOM的划分准确率为42/55=76%。
如果加上与SCOP指出的结构域一致的3个蛋白质,
则准确率上升为45/55=82%。
这13个蛋白质的结构域虽然和晶体结构作者确定的结构域不一致, 但这并不一定意味我们的划分结果不准确。 这种不一致很大程度上是由于缺乏一个结构域的标准定义所造成的。 表1中晶体结构作者确定的结构域和SCOP指出的结构域不一致的例子就有6个, 包括1ppn、
1vsgA、 2had、 1phh、
1atnA、 8acn。

PDOM划分结果中11个不一致的例子可以分为两种不同情况: 第一种是结构域数目不一致, 有2ace、 1bbhA、
1rveA、 4blmA、 1gpb、
2cyp、 1g6nA、 1phh、
3pmgA 等9个; 第二种是结构域数目一致但结构域残基范围不一致, 只有3grs一个。 属于第一种情况的9个例子又可以细分为两类: 其中2ace、
1bbhA、 1rveA、 4blmA、
1gpb（图1）, PDOM比晶体结构作者划分出更多的结构域; 而对2cyp、 1g6nA、
1phh、 3pmgA（图2）,
PDOM比晶体结构作者划分出更少的结构域。

我们先来讨论2ace、 1bbhA、
1rveA、 4blmA、 1gpb五个例子（图1）。
2ace(乙酰胆碱酯酶)的C端α螺旋(518～535)和蛋白质在细胞膜上的定位有关, 而Cys402和Cys521之间的二硫键将(337～402)与(517～535)连接成为一个完整的细胞膜定位结构域。
因此PDOM将2ace划分为一个小的定位结构域(337～402, 517～535)和一个大的催化结构域(4～336,
403～516), 催化结构域保持了Ser200、
Glu327、 His440催化三联体在同一结构域内[20], 两部分功能不同,
符合我们对结构域的定义, 因此是合理的。 PDOM将1bbhA(细胞色素C, CVCP)划分为(1～71)和(72～131)两个结构域,
两个结构域都由两个连接很紧密的α螺旋组成, 一个松散的长卷曲(coil)将两个结构域连接起来。
从折叠的角度来看, 两个结构域由于二级结构含量非常丰富, 且结构上比较紧密, 两个结构域的α螺旋部分疏水部分相向, 因此, 单独存在也比较稳定, 虽然,
我们还没有功能或其他方面的数据, 但是这样的划分也无可非议。 1rveA(限制性内切酶EcoRV)的C端三个α螺旋(209～218,
223～228, 233～242)与蛋白质其他部分明显分离（图1）, 该酶的功能部分主要在N端结构域,
而C端结构域是否有其他的功能还有待阐明, 从它所处的位置来看, 似乎和控制底物进入活性部位有关。
因此PDOM将它划分为(2～205)和(206～245)两个结构域, 似乎也有其合理性。
对于1gpb(肝糖磷酸化酶), PDOM与晶体结构作者在结构域划分上的主要差别在于PDOM多划分出了一个小结构域(714～775), 图1的1gpb结构域示意图中用黑色标记的即为该小结构域。
我们在计算中要求每个结构域的紧密度都必须大于0.52, 这是一个经验数值, 而判断一个结构域是否足够紧密是有一定主观性, 并没有一个绝对的数值标准;
上述小结构域的紧密度有0.521, 恰好在阈值附近, 因此PDOM也可以不把它单独划分为一个结构域。 肝糖磷酸化酶是调节糖代谢的一个关键酶, 受到很多分子的调节, 关于对它的调节, 还有许多工作要做,
我们把它这尽管差别不大的部分划成一个结构域, 也希望提出一个对它的调节功能研究的途径。

β–内酰胺酶A链(PDB编号4blmA)（图1）, Moews 等认为,
β–内酰胺酶的催化残基Ser70和保守的Lys73可能存在氢键作用, 并且Lys73还与Asn132、
Glu166有相互作用, 而Lys234、
Thr235、 Ala237则和β–内酰胺底物的结合有关[21]。
PDOM将这个蛋白质划分为一个催化结构域(70～169)和一个结合结构域(31～69, 170～291)（图1）,
这一点与Moews 等对该酶的催化和底物结合的讨论并不矛盾。 在许多酶中,
都是底物结合和催化分属于两个不同的结构域, 也符合结构域是一个功能的单位的概念。 从结构的角度来看,
这两个结构域的边界也是比较明显的。

Fig.1       Carton of 3-D structures of
domains in proteins

Domain assignments of 2ace, 1bbhA, 1rveA,
4blmA and 1gpb by PDOM. Both crystrallographer and SCOP assign 2ace, 1bbhA,
1rveA and 4blmA as single-domain proteins, and 1gpb as two-domain protein. The
black, dark-gray and silver-gray ribbons show different domains. The PDB code
is given at top left corner each protein structure. Consult Table 1 for residue
ranges of domains.

对2cyp、 1g6nA、
1phh、 3pmgA四个例子（图2）, PDOM比晶体结构作者划分出更少的结构域。
晶体结构作者将2cyp（细胞色素过氧化物酶）划分为(3～145,
266～294)和(164～265)两个结构域, 而将残基146～163切除。 残基相互作用分析表明[22], 残基146～163与两个结构域都有较强的氢键和疏水作用, 人为地任意将这些残基从蛋白质中剔除, 再将蛋白质划分为两个结构域的做法显然难以令人信服。 PDOM则考虑了残基146～163与蛋白质其他部分的作用, 认为将蛋白质定为单结构域是合理的。
1g6nA（DNA结合蛋白）的不一致仅仅是由于C端结构域（138～206）的紧密度在阈值附近而造成的, 实际上该C端结构域的紧密度为0.513, 和阈值(0.520)并没有明显差别, 因此PDOM也可以将1g6nA划分为(7～137)和(138～206), 这与晶体结构作者和SCOP的划分一致。 3pmgA(葡萄糖磷酸变位酶)的不一致主要在于残基300～561的划分,
晶体结构作者和SCOP都将它继续划分为两个结构域。 如果PDOM将残基300～561看作一个完全独立的部分, 即不考虑残基1～299对它的影响,
也可以将残基300～561继续划分为300～420和421～561两个结构域,
与晶体结构作者和SCOP的结果一致。 然而人为地对一个蛋白质的部分结构进行取舍, 我们认为是不可取的。

Fig.2       Carton of 3-D structures of
domains in proteins

Domain assignments of 2cyp, 1g6nA, 1phh
and 3pmgA by crystrallographer. Crystrallographer assigns 2cyp and 1g6nA as
two-domain proteins, 1phh as three-domain protein, 3pmgA as four-domain
protein. The black, dark-gray, silver-gray solid ribbons and silver-gray line
ribbon show different domains. The PDB code is given at top left corner of each
protein structure. Consult Table 1 for residue ranges of domains.

p-羟基苯甲酸羟化酶(p-hydroxybenzoate
hydrox-ylase)的PDB编号为1phh（图2）, PDOM认为这个蛋白质是单结构域,
晶体结构作者则划分为(1～175)、
(176～290)和(291～394)三个结构域, SCOP则划分为(1～173, 276～394)和(174～275)两个结构域。 PDOM和这两种手工划分结果都不一致。
两种手工划分结果之间也不一致。 Schreuder等[23]研究了p-羟基苯甲酸羟化酶的催化循环和羟化位点, 发现反应产物二羟基苯甲酸(DHB, 3,4-dihydroxybenzoate)的3-位羟基与Pro293的主链羰基氧形成氢键, 4-位羟基与Tyr201的羟基形成氢键, 羧基则与Tyr222,
Arg214和Ser212相互作用。 这说明Pro293, Tyr201, Tyr222, Arg214和Ser212等五个残基参与了催化反应循环, 缺少了它们则酶的催化循环反应可能无法正常进行, 尤其是Pro293和Tyr201可能直接参与了羟化过程。 从以上分析知道,
两种手工划分结果都将催化残基Pro293与Tyr201及其它四个催化相关残基划分到不同结构域, 而PDOM则将它们划分在一个催化结构域保持了催化结构域的完整性。 另外,
两种手工划分结果都将属于同一个β折叠的残基75～79与残基199～204划分到不同结构域。
因此PDOM将1phh划分为单结构域似乎更合理一些。
应该指出的是: 1phh的结构是在FAD和3,4-二羟基苯甲酸存在下测定的, 辅酶和产物的结合对结构域所产生的影响是不容忽视的。 目前有许多蛋白质在没有底物、 底物类似物、 产物、 或抑制剂存在下, 不能得到可供结构分析的结晶, 因此也在一定程度上影响了结构域的划分和各种划分结构域方法的准确比较。

PDOM与晶体结构作者不一致的例子中还有一个谷胱甘肽还原酶（3grs）。 它是两者划分结构域数目一致, 但结构域的残基范围不同。
从结构域示意图中可以看出（图3）: 中间结构域(55～96, 158～293,
334～367)夹在N端结构域(18～54, 97～157,
294～333)和C端结构域(368～478)之间。 从表1可以看出,
PDOM与晶体结构作者的不一致主要来自于对残基55～96和残基334～367的划分。 残基相互作用分析表明[22], 残基55～96与N端结构域, 中间结构域和C端结构域分别存在14个,
7个和14个氢键作用, 残基334～367与N端结构域, 中间结构域和C端结构域分别存在14个,
1个和6个氢键作用。 由于这两部分残基不但与N端结构域有作用而且与C端结构域也有作用,
因此使得PDOM没有将它们划分给这两个结构域。 如果PDOM将3grs划分为(18～367)和(368～478)两个结构域后,
在对残基18～367继续划分结构域时不考虑C端结构域(368～478)对它的作用, 则最后可以将残基18～367划分为与晶体结构作者的结果一致的N端结构域和中间结构域。

Fig.3       Carton of 3-D structures of
domains in 3grs

Domain decomposition of 3grs by PDOM.
PDOM assigns residues 55－96
and 334－367
to the middle domain. The black, dark-gray and silver-gray ribbons show
different domains: black for C-terminal domain (368－478),
dark-gray for middle domain (55－96,
158－293, 334－367),
silver-gray for N-terminal domain (18－54,
97－157, 294－333).

一个结构域是否足够紧密以及两个结构域是否互相依赖或是否可以分离, 其判断没有一个确定的定量标准, 有一定的任意性。 由于个人主观经验和所关注问题的不同, 不专家对同一个蛋白质所做的结构域划分可能不一致, 但是他们都有自己的解释。

PDOM比我们以前发展的结构域划分方法适用范围更广, 可以同时处理连续和不连续结构域的情况。
譬如磷酸甘油酸激酶(PDB编号3pgk), 分离结构域的一系列实验表明包含螺旋的C端肽段(401～415)对于N端结构域非常重要, 虽然缺少这个C端肽段时1～185也可以自发折叠并稳定存在, 但是构象和天然态差别较大[24,25],
加上这个肽段形成一个不连续结构域, 则可以折叠成和天然态类似的构象[24,25]。 PDOM成功地将磷酸甘油酸激酶划分为一个连续结构域(190～403)和一个不连续结构域(1～189, 404～415)（图4）,
与分离结构域实验报道的结果一致。

Fig.4       Carton of 3-D structures of
domains in 3pgk

Domain decomposition of 3pgk by PDOM.
PDOM assigns C-terminal helix to the other domain to form a discontinuous
domain. The dark-gray and silver-gray ribbons show different domains: dark-gray
for (1－189, 404－415),
silver-gray for (190－403).

虽然目前还没有一个普遍认同的结构域标准定义, 但是我们的结构域划分法（PDOM）是从蛋白质结构域是结构、 功能、 折叠、 进化和设计的单位这几个特征去考虑, 而自由能概括了上述定义的共同特征。 由于结构域的结构特征是最直观和最容易实现的, 因此目前划分结构域的计算机方法, 大多是基于结构域作为结构单位的观点, 不断地调整方法以适应直观的结构特点。 PDOM引入去折叠自由能来划分结构域, 基本上反映了上述五个方面的主要特征。
依此编制的计算机程序对55个蛋白质进行结构域划分得到了比较满意的结果（在我们整理论文时, 了解到Guo等在网站上发布的最新数据,
发现他们采用不同方法并与手工方法相比可以给出80%符合率的结果, 但我们并没有从他们最近的论文中看到所有数据[12]）。 结构域的各种特征中最受关注的, 也许是其作为功能单位的特征, 然而, 目前还没有好的方法, 用一个共同的数学的表式来反映功能的多样。
对于这一问题, PDOM还只是仅仅考虑到结构和功能具有统一性, 而忽略了其他方面（也许是比较重要的）的贡献。 显然PDOM还不够完善, 这也正是今后结构域的划分中需要进一步思考之处。

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Updated
at: 2003-12-16