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Effects
of Site-directed Mutagenesis at Amino Acid Residues of GATA-1b Different from
That of GATA-1a in Xenopus
FENG
Xiang-Ling, LIU Wei-Dong, LI Hong, WANG Lei, YANG Xu-Yu, HAN Wei-Nong, ZHOU
Wen, YAO Kai-Tai*
( Cancer Research Institute, Xiangya
Medical School of Central South University, Changsha 410078, China )
Abstract The
GATA-1 of Xenopus (xGATA-1), which has two subtypes xGATA-1a and xGATA-1b, is a
necessary factor for erythroid differentiation and maturation as similar as
that of other GATA-1s. Although both xGATa-1a and xGATA-1b are able to
stimulate erythropoiesis, only xGATA-1b is capable of inhibiting neurogenesis
in Xenopus embryos. Compared between their structures, xGATA-1a and xGATA-1b
are very similar in nucleotide and amino acids composition, but not identical.
Therefore, it is responsible for studying the role of the diverse codons
between the two genes, so the desired mutations: S168, H169 double deletion and
point mutation of T304→A, T359→A, were introduced into xGATA-1b gene through
site-directed mutagenesis. Then, mRNA from each mutant as well as wtxGATA-1b
was co-injected with DN-BR mRNA or separately injected into Xenopus stage 2
embryos, and the role of mutants in erythropoiesis and neurogenesis was
analyzed by using animal cap culture system. The results showed that the
neural-inhibiting activity of xGATA-1b, but not hematopoiesis-inducing
activity, was aborted because of deletion of Ser168 and His169 or point
mutation of T359→A. So it is demonstrated for
the first time that Ser168 and His169 or Thr359 in xGATA-1b may be one of the
structural basis for explanting the different function between xGATA-1b and
xGATA-1a.
Key
words Xenopus laevis;
GATA-1b; mutation
___________________________________________
Received:
June 24, 2003 Accepted:
October 21, 2003
This
work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of
China (No. 39910161994)
*Corresponding
author: Tel, 86-731-4805451; Fax, 86-731-4360094; e-mail, [email protected]
非洲爪蟾GATA-1b中与GATA-1a的差异位点突变后的功能
冯湘玲 刘卫东 李 虹 王 磊 杨旭宇 韩为农 周 文 姚开泰*
（
中南大学湘雅医学院肿瘤研究所, 长沙 410078 ）
摘要 非洲爪蟾GATA-1因子分为GATA-1a和GATA-1b两种亚型。 与其他种类的GATA-1因子相类似,
GATA-1是红细胞分化成熟所必需的因子之一。 二种亚型在造血方面具有同样的作用, 但只有xGATA-1b具有抑制神经发生的功能。 比较二者的结构,
发现二者的核酸和蛋白质结构虽然都非常相似, 但并不完全一致。 为探讨这些差异结构与功能之间的关系, 我们对xGATA-1b中与xGATA-1a差异的Ser168和His169位点进行缺失突变, 并定点突变Thr304和Thr359位点。 之后将体外制备好的野生型或突变型xGATA-1b mRNA单独或与DN-BR mRNA共同导入非洲爪蟾2细胞胚胎内, 利用动物帽系统分析突变体在神经发生和造血方面的功能。 结果发现, Ser168和His169以及Thr359位点突变后, xGATA-1b再不能抑制DN-BR诱导的神经发生; 但所有突变都未影响xGATA-1b在造血方面的功能。 由此, 我们首次证实了Ser168和His169以及Thr359位点可能是导致xGATA-1b和xGATA-1a之间功能分离的结构基础之一。
关键词 非洲爪蟾; GATA-1b; 突变
GATA-1是转录因子家族GATA蛋白重要成员之一。 与其他五个成员（GATA-2～GATA-6）一样,
GATA-1主要通过两个高度保守的锌指结构Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys识别共有序列(consensus motif)(T/A)GATA(A/G),反式调节基因的表达[1]。 GATA-1基因主要在红细胞、巨核细胞和肥大细胞系中表达, 参与包括珠蛋白在内的几乎所有红细胞特异基因的表达调控[2～4], 是红细胞分化成熟所必需的因子[5,6]。
1991年Zon等[7]首先分离出了非洲爪蟾GATA-1（xGATA-1）基因,
并经证实该基因存在两种亚型, 即xGATA-1a 和xGATA-1b。
与其他物种的GATA-1比较, 此两种基因也编码了高度保守的锌指结构, 因而在造血系统中具有相类似的作用。 1997年Xu等[8]首次发现xGATA-1a和xGATA-1b在神经发生过程中具有完全不同的功能; xGATA-1b具有与BMP-4相似的作用,
能够抑制由noggin、 chordin、
DN-BR (dominant negative BMP-4 receptor) 等因子诱导的神经发生,
但是xGATA-1a却不具备此功能。 通过比较xGATA-1a和xGATA-1b的结构发现,
二者虽然在核酸和蛋白质水平分别具有87%和89%的同源性,
但是它们的cDNA全长不同, 分别为1854
bp和1303 bp, 同时在所推导出的氨基酸顺序上也不完全一致[7,8]。
例如在xGATA-1b蛋白保守的DNA结合域的上游5′端插入了两个氨基酸, Ser168和His169。
同时xGATA-1b中
的Glu362、Leu363及Ala364三个氨基酸在xGATA-1a的C末端却不存在。 而xGATA-1a剩余的359个氨基酸残基中,
有38个与xGATA-1b蛋白不同。 其中有4个突变位于DNA结合域, 分别为:
Met195→Leu, Val224→Ile, Ser248→Gly,
Arg286→Lys; 其余１６个改变被认为属于保守性改变。
本实验对xGATA-1b功能域内的差异位点Ser168、His169、Thr304和Thr359位点进行定点突变或缺失突变, 研究xGATA-1b结构差异与功能差异之间的关系, 为进一步阐明xGATA-1b与xGATA-1a之间功能差异的分子机制提供可能。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 质粒与细菌 含有编码转录因子GATA-1b全长cDNA的载体pBluesript(2.98 kb)以及含有显性负性骨形成蛋白2/4（BMP2/4）受体DN-BR的670
bp长cDNA的载体pSP64T（约为3
kb）均由香港大学分子生物学研究所孔祥复教授赠送[8]。
基因扩增采用E.coli DH5α和XL1-Blue。
1.1.2 动物 非洲爪蟾为3～5年蛙龄、性成熟的成年蛙, 购自中科院发育生物学研究所及中科院生化与细胞研究所。
1.2 方法
1.2.1 定点突变[9] 首先进行pBS-GATA-1b质粒转化、抽提和鉴定工作,
然后采用Plasmid mini purification
kit(Qiagen公司)制备经过鉴定的质粒模板, 针对GATA-1b基因靶位点设计三对引物, 分别引入S168、H169双缺失,
T304→A及T359→A特定突变, 具体引物序列如下:
引入xGATA-1b的Ser168、His169双缺失突变引物设计如下:
上游引物: 5′-ggaggaggagggcaggagttc(agccac)ag-tctgtttcagtccacagaa-3′
下游引物: 5′-ttctgtggactgaaacagact(gtggct)gaac-tcctgccctcctcctcc-3′
引入T304→A突变位点的引物设计如下:
上游引物: 5′-ccttttgagcctccaaaag(a)caggagttgaggaacca-3′
下游引物: 5′-tggttcctcaactcctgc(t)ttttggaggctcaa-aagg-3′
引入T359→A 突变位点的引物设计如下:
上游引物: 5′-tattcagcatcaggggtag(a)cgccccccg-agttagca-3′
下游引物: 5′-tgctaactcggggggcgc(t)tacccctgat-gctgaata-3′
引物序列的括号内为原碱基, 括号前为突变碱基。 具体操作步骤参考说明书。
1.2.2 DNA与RNA的制备制备 纯化的无RNase污染的DNA模板。 首先采用Qiagen plasmid mini
purification kit抽提质粒DNA, 分别用相应的酶线性化模板DNA, 蛋白酶K和SDS处理后,
经苯酚–氯仿抽提纯化得到线性化模板DNA。 利用MEGAscriptTM in vitro transcription kit
(Ambion公司)体外合成带帽的mRNA。 合成的RNA经琼脂糖凝胶电泳以及分光光度计分析并定量, 证实其纯度符合实验要求。
1.2.3 体外翻译 参考Retic lysate IVTTM in vitro translation
kit (Ambion公司)说明书操作。 在反应体系中加入经体外转录制备好的RNA模板, 以[35S]-甲硫氨酸进行标记, 30 ℃水浴培育90
min; 分别加入2.5 μL RNase, 30 ℃水浴处理10 min; 取出样品置于冰上5
min。 进行SDS-PAGE电泳, 于－70
℃放射自显影20天至1个月。
1.2.4 非洲爪蟾胚胎显微注射详 细操作请参考具体文献[10]。
1.2.5 非洲爪蟾动物帽显微切割 胚胎培养到胚胎发育阶段的8～9期[11]时, 于体视显微镜下对胚胎动物极向外周延伸25％～30％的色素沉着范围切割, 外植体用L-15培养基, 20～22
℃温箱中培养至相当于整体胚胎的st.35期[11]时观察动物帽(animal
cap, CA)的生物学特征。 照相,
收获检测。
1.2.6 RT-PCR检测 采用Trizol试剂（Gibco
BRL 公司产品）抽提动物帽RNA, 溶解在5 μL
DEPC水中, 1 μL DNase I（140
IU/μL）消化痕量的DNA, 37 ℃水浴1
h, 用DEPC水稀释至200 μL,
加入0.5 mL的Trizol抽提纯化,
重新用5 μL DEPC水溶解RNA。
采用RT-PCR试剂盒（Promega公司,
Reverse transcription system）检测N-CAM, 蝌蚪α–珠蛋白(tadpole
α-globin, Tα–珠蛋白)基因, EF-1α(对照)。 所用引物见表1。
扩增EF-1α的PCR反应参数:
95 ℃、5 min; 94 ℃、30 s, 58 ℃、30
s, 72 ℃、30 s, 32 个循环; 72 ℃、10
min。
扩增N-CAM的PCR反应参数:
95 ℃、5 min; 94 ℃、40 s, 58 ℃、40
s, 72 ℃40 s, 35 个循环; 72 ℃、10
min。
扩增Tα–珠蛋白基因的PCR反应参数: 95 ℃、5
min; 94 ℃、 1 min, 54 ℃、
1 min, 72 ℃、1
min, 30个循环; 72 ℃、10 min。
Table 1 Primers for amplifying N-CAM, Tα-globin gene and EF-1α, respectively
|
Genes |
Size (bp) |
Primers |
Ref. |
|
EF-1α |
268 |
U: 5’–CAGATTGGTGCTGGATATGC-3’ D: 5’–ACTGCCTTGATGACTCCTAG-3’ |
[12] |
|
N-CAM |
342 |
U: 5’–CACAGTTCCACCAAATGC-3’ D: 5’–GGAATCAAGCGGTACAGA-3’ |
[13] |
|
Tα-globin |
318 |
U: 5’–CATGGCTCTGCTGATCTTGCCAACCAC-3’ D: 5’–CCCAGGCGTGTGAGCTGCCCTTGCTG-3’ |
[8] |
U,
up primer; D, down primer.
2 结果（Results）
2.1 通过PCR在xGATA-1b相应位点引入突变
本实验运用生物信息学的方法, 在进行转录因子xGATA-1b 和xGATA-1a同源性比较分析的基础上,
通过对二者的二级结构 (SOPMA软件)[14]以及二者蛋白质特征和磷酸化位点的预测和比较, 初步选出xGATA-1b中与xGATA-1a具有结构差异或磷酸化差异的三处位点（图1）,
即Ser168、 His169, Thr304, Thr359。
Fig.1 Mutation sites in GATA-1b
The shadow part shows the zinc finger
region.
本实验通过PCR反应在xGATA-1b的差异相应位点引入突变。
PCR产物在经DpnI酶消化处理后, 用1％琼脂糖凝胶电泳检测突变反应。 结果表明在电泳图中目的样品以及阳性对照泳道中有一清晰条带, 位置正确,
未见非特异带; 而阴性对照没有条带。 这表明经PCR反应后, 已经在模板中引入突变。
此后, 经DNA测序进一步证实,
在挑取的克隆中, 均在相应的位点引入了正确的突变, 除此之外,
全长序列测定也未发现在其他位点发生自发突变。
2.2 体外翻译结果
据报道,
xGATAT-1b翻译产物大小为39 kD。
如图2所示, 编码三种突变体（G1bM4体外翻译结果未显示）的mRNA的翻译产物与野生型xGATA-1b翻译产物在PAGE胶上的位置一致。 由此可见, 体外转录获得的突变子mRNA能正确翻译, 说明所选择的4个突变位点并未影响翻译能力。
Fig.2 Translation of wild and mutant
type GATA-1b RNAs in vitro
1,
expressed product of xGATA-1b RNA in vitro; 2, expressed product of G1bM1 RNA in
vitro; 3, expressed product of G1bM2 RNA in vitro; 4, expressed product of
G1bM3 RNA in vitro.
2.3 xGATA-1b突变体在非洲爪蟾神经发育中的作用
采用非洲爪蟾显微操作系统,
于爪蟾胚胎发育的2细胞期将目的基因RNA注射入胚胎胞质内。
研究表明, DN-BR能够诱导爪蟾神经发生, 使得动物帽呈现神经化表型;
而GATA-1b能够抑制由DN-BR诱导的神经发生[8],
因此在研究中, 我们以注射DN-BR RNA的动物帽表型为阳性对照[图3(B)], 而以xGATA-1b
RNA与DN-BR RNA共注射以及xGATA-1b RNA单独注射的动物帽表型为阴性对照[图3(C),(H)]。
结果显示, 突变体G1bM1、G1bM2、G1bM4的RNA与DN-BR RNA共注射时,
动物帽呈现一半白色、一半黑色或全部白色, 即发生了神经化[图3(D),(E),(G)]。
而G1bM3 RNA与DN-BR RNA共注射时,
动物帽呈现为圆形、全黑, 即表现为上皮化[图3(F)]。
在四种突变体RNA单独注射时, 动物帽均表现为上皮化[图3(I),(J),(K),(L)]。
RT-PCR分析神经粘附分子N-CAM的表达情况（图4）, 从分子水平上分析xGATA-1b突变后在神经发育方面的作用。 N-CAM是一种泛表达神经化分子, 它是神经诱导的早期反映分子[13]。 结果证实,
与以上生物学表型相一致, 突变体G1bM1、G1bM2、G1bM4的RNA与DN-BR RNA共注射的AC和阳性对照一致, 均表达N-CAM;
而G1bM3 RNA与DN-BR RNA共注射实验组和野生型或突变型xGATA-1b RNA单独注射实验组、空白对照组以及阴性对照的AC均未表达N-CAM。
Fig.3 Morphological observation of
animal cap
Differential effects of wt or mt
xGATAT-1b on neruogenesis elicited by DN-BR, or directly inducing neruogenesis
of animal cap. 1 ng of DN-BR RNA was coinjected with RNA encoding wt or mt
xGATA-1b (2 ng) into the two blastomeres of Xenopus embryos at the 2-cell
stage. Animal caps were excised at stage 8－9
followed by cultivation until sibling controls reached tailbud stage. (A) blank
control (injected water) (25×);
(B) DN-BR (20×);
(C) DN-BR+xGATA-1b (25×);
(D) DN-BR+G1bM1 (20×);
(E) DN-BR+G1bM2 (20×);
(F) DN-BR+G1bM3 (25×);
(G) DN-BR+G1bM4 (25×);
(H) xGATA-1b (25×);
(I) G1bM1 (25×);
(J) G1bM2 (25×);
(K) G1bM3 (25×);
(L) G1bM4 (20×).
Fig.4 Expression of N-CAM, EF-1α in animal cap detected by RT-PCR
(A) N-CAM. (B) EF-1α.
Animal cap in proper order were derived from embryos injected with different
genes. M, DNA ladder marker; 1, blank control (injected water); 2, DN-BR; 3,
DN-BR+xGATA-1b; 4, xGATA-1b; 5, DN-BR+G1bM1; 6, G1bM1; 7, DN-BR+G1bM2; 8,
G1bM2; 9, DN-BR+G1bM3; 10, G1bM3; 11, DN-BR+G1bM4; 12, G1bM4; 13, embryo
control; 14, control (no reverse transcription).
由此,
不仅从表型研究可以初步推断, 而且在分子水平上也可证实: 突变体G1bM1(S168、H169双缺失)、G1bM2(T304→A,T359→A)、G1bM4(T359→A)丧失了神经抑制功能,
但突变体G1bM3(T304→A)仍具有神经抑制功能。
分析四种突变体单独注射实验组, 可以推断经突变后xGATA-1b也并不具有神经诱导的作用。
2.4 xGATA-1b突变体在非洲爪蟾造血功能方面的作用
Tα–珠蛋白基因是成熟红细胞内表达的标志基因, 主要包括αT3, αT4,
αT5三种类型, 在蝌蚪发育早期以及晚期都有表达, 最早被检测到表达是在胚胎发育的30期[15]。 在本实验中引物设计用于检测Tα–珠蛋白基因的αT3型。 经RT-PCR分析,
在空白AC、注射DN-BR RNA的AC未能检测到Tα–珠蛋白基因的表达, 而在野生型或者突变型xGATA-1b
RNA单独注射实验组以及胚胎中均检测到Tα–珠蛋白基因的表达(图5)。 由此可见, xGATA-1b在Ser168、 His169、
Thr304、 Thr359四个位点突变时, 未改变其在爪蟾造血发育中诱导红系分化的作用。
Fig.5 Expression of Tα-globin gene, EF-1α in animal cap detected by RT-PCR
(A) Tα-globin
gene. (B) EF-1α.
Animal cap in proper order were derived from embryos injected with different
genes. M, DNA ladder marker; 1, blank control (injected water); 2, DN-BR; 3,
xGATA-1b; 4, G1bM1; 5, G1bM2; 6, G1bM3; 7, G1bM4; 8, embryo control; 9, control
(no reverse transcription).
3 讨论(Discussion)
非洲爪蟾GATA-1是以锌指结构为特征的转录因子, 在锌指结构缺失后,
xGATA-1a和xGATA-1b都不能激活珠蛋白表达, 同时,
xGATA-1b也不能抑制由DN-BR等诱导的神经发生。 可见, 锌指结构是保证xGATA-1结构完整性和特异性结合靶基因并行使正常功能的基础, 但不可能是导致二者功能差异的唯一结构, 这就提示在xGATA-1b中必然存在其他重要的结构参与抑制神经发生。 虽然xGATA-1a和xGATA-1b在核酸和蛋白质结构上都高度同源, 但并非完全一致。 孔祥复教授及其同事[16]通过构建不同的嵌合型表达载体发现, xGATA-1b的3′端非翻译区是xGATA-1b抑制神经发生的重要部位, 可能是两个因子功能分离的重要分子基础。
在所推测出的氨基酸序列中, 二者存在许多位点差异。 孔祥复教授及其同事[16]对xGATA-1b中C末端的 Glu362、
Leu363以及Ala364三个氨基酸进行了缺失突变, 未发现xGATA-1b因此丧失了抑制神经发生的功能。 本研究在此基础上利用生物信息学方法进一步分析和比较二者的氨基酸序列, 选择四个位点进行了突变研究。
功能分析结果显示, 两种突变体G1bM1(S168、H169
deletion)和G1bM2(T304→A、T359→A)均丧失了抑制DN-BR诱导的神经发生的能力。 之后对Thr304,
Thr359进行单独突变分析, 以期找出G1bM2中起关键作用的位点。
实验结果表明G1bM4(T359→A)不能抑制DN-BR诱导的神经发生, 而G1bM3(T304→A)则相反。 这提示168, 169和359位的氨基酸可能是xGATA-1b维系其神经抑制功能的其他重要结构之一。
另外,
我们对三个突变体进行神经诱导能力分析, 发现即使G1bM1和G1bM4不能抑制神经发生, 但也未因此获得神经诱导的能力。
这说明所选择的突变位点并非xGATA-1b显性负性的突变点, 这些突变体与BMP-4受体的显性负性突变体DN-BR不同,
不是在失去本身功能的情况下而产生新的反效应。 对突变体在造血方面作用的分析结果表明, 三个突变体均能调节Tα–珠蛋白基因的转录,
由此可见本实验所选择的四个突变位点并未改变xGATA-1b的在造血方面的功能, 而仅仅是可能影响其在神经发生方面的作用。
由于四个突变位点是xGATA-1b中与xGATA-1a差异的位点,
综合以上分析结果, 我们认为Ser168、
His169在N末端锌指结构域前插入, 以及Thr359位点是xGATA-1b发挥神经抑制功能结构基础之一, 也是造成xGATA-1b与xGATA-1a之间功能分离的分子基础之一。
转录因子xGATA-1b的结构非常复杂, 除锌指结构、 苏氨酸磷酸化位点外, 还有赖氨酸乙酰化位点、
丝氨酸磷酸化位点等; 要完全了解xGATA-1a和xGATA-1b之间功能差异的分子结构基础还需要做更多的努力。 但通过本研究,
我们至少找到了两处有意义的功能位点, 即Ser168、
His169双位点和Thr359位点对于维持蛋白质结构的完整性及其功能发挥有着十分重要的意义, 也是造成xGATA-1b与xGATA-1a之间功能分离的结构基础之一。 这对于阐明xGATA-1b在神经发生中的作用机制有着极为重要的意义。
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