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Cloning
and Expression of Tumor Necrosis Factor (TNFα)
cDNA from Red Seabream Pagrus major
CAI
Zhong-Hua1,2, SONG Lin-Sheng1*,
GAO Chun-Ping3, WU Long-Tao1, QIU Li-Hua1, XIANG
Jian-Hai1
( 1 Institute of Oceanology,
the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2 Tianjin
Agricultural College, Tianjin 300381, China; 3 Ocean university of
China, Qingdao 266003, China )
Abstract A
fragment of TNFα cDNA sequence from red
seabream was cloned by homology cloning approach with two degenerated primers
which were designed based on the conserved regions of other animals’ TNF
sequences. The sequence was elongated by 3′
and 5′ RACE to get the full length
CDS sequence. This sequence contained 1264 nucleotides that included a 5′ UTR of 85 bp, a 3′ UTR of 514 bp and an open reading frame
(ORF) of 666 bp which could encode 222 amino acids propeptide. In 3′ UTR, there were several mRNA instability
motifs and three endotoxin-responsive sequences, but the sequence lacked the
polyadenylation signal. The deduced peptide had a clear transmembrane domain, a
TNFα family signature and a TNF2
family profile. The cell attachment sequence and the glycosaminoglycan
attachment sites were also found in the sequence. The red seabream TNF sequence
shared relatively high similarity with both mammalian TNFα and TNFβ
by multiple sequence alignments. Phylogenetic analysis showed that the piscine
TNFα were located independently in
a different branch compared with mammalian TNFα
and TNFβ. Based on the primary and
secondary structure analysis and gene expression study, we could concluded that
the red seabream TNF should be a TNFα,
not TNFβ. RT-PCR was used to study TNFα transcript expression. 24 h after the
red seabream was challenged by Vibrio anguillarum, the RS TNFα transcript expression were detected in
blood, brain, gill, heart, head kidney, kidney, liver, muscle and spleen.
Results showed that TNFα mRNA was constitutively
expressed in parts of the tissues both in stimulated and unstimulated fish and
the expression could be enhanced after the pathogen infection.
Key
words red seabream (Pagrus
major); tumor necrosis factor (TNFα);
cloning; mRNA expression
________________________________________
Received:
July 8, 2003 Accepted:
September 16, 2003
This
work was supported by a grant from the Major State Basic Research Development
Program of China (973 Program) (No. G1999012008), the National High Technology
Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2001AA628180), and
the Post Doctoral Scholarship of K.C. WANG Education Foundation (No.
20011002110140)
*
Corresponding author: Tel, 86-532-2898552; Fax, 86-532-2898578; e-mail, [email protected]
真鲷肿瘤坏死因子α（TNFα）cDNA的克隆与表达
蔡中华1,2 宋林生1* 高春萍3 吴龙涛1 邱丽华1 相建海1
( 1中国科学院海洋研究所实验海洋生物重点实验室, 青岛 266071; 2天津农学院水产科学系, 天津
300384; 3中国海洋大学生命科学院, 青岛 266003 )
摘要 采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）的方法, 从真鲷中克隆到1264 bp 的TNFα全cDNA编码序列（GenBank
登录号为AY314010）。
该序列包括666 bp可读框（ORF）,
85 bp的5′末端非编码区（UTR）以及514
bp的3′末端非编码区。 序列的3′UTR含5个mRNA不稳定模体(motif)和3个内毒素应答序列,
但是未发现基因的Poly A加尾信号。 由该序列推导的多肽含有明确的跨膜域, TNF家族的标签序列(signature), TNF2家族分布（profile）文件,
粘多糖结合位点和细胞粘附位点。 进化分析显示,
真鲷TNF与哺乳类TNFα和TNFβ具有较高的相似性, 源于共同的祖先。 但结构及表达分析表明, 它是TNFα而不是TNFβ。 表达研究显示, 真鲷TNFα存在组成型和诱导型两种表达形式, 表现在刺激与非刺激的真鲷中, TNFα均可在部分组织中表达,
但是在受刺激鱼体中基因表达的组织分布显著增多。
关键词 真鲷; 肿瘤坏死因子α（TNFα）;
克隆; 表达
肿瘤坏死因子（tumor
necrosis factor, TNF）是一种存在于动物体内、 能杀伤某些肿瘤细胞并使肿瘤组织发生出血性坏死的小分子蛋白质。 哺乳类的TNF可以分为TNFα和TNFβ。一般地, 肿瘤坏死因子泛指TNFα, 它由单核、巨噬细胞、NK细胞以及平滑肌、成纤维细胞等经LPS、细胞因子、免疫复合物以及肿瘤细胞等多种物质刺激产生, 有广泛的组织分布。
TNFα与TNFβ有相似的生物学活性, 是一种重要的炎症介质[1,2]。
皮克(pg)量级的TNF已经具有调控细胞毒性反应而引起细胞凋亡、
刺激信号转导、 协调特异性和非特异性免疫反应[3,4]等多种功能。
由于TNF具有广泛生物学活性及其在免疫系统中的重要作用, 多年来人们一直在低等动物中寻找TNF存在的证据。 Ottaviani等[5]和Wittwer等[6]分别在软体动物和昆虫中发现有TNF类似成分。
Hardie等[7]和Qin等[8]应用生物学交叉反应, 证明了鱼类存在TNFα类似的成分。 Hirono等[9]于2000年通过EST技术首次从牙鲆中克隆到TNFα基因。 Laing等[10]和Zou等[11]于2001年应用同源基因克隆技术,
从虹鳟鱼中克隆到两个结构相近的TNFα基因。 应用同源克隆、EST和差显文库技术, 目前已在鱼类和多种动物中都获得了TNFα基因[12～15], 为研究TNF在鱼类免疫中的作用及开发其生产应用价值奠定了基础。
真鲷(Pagrus
major)是我国重要的海水鱼类养殖品种, 因其肉质鲜美, 色泽喜庆,
蕴含吉祥, 多年来一直深受人们的喜爱, 是我国重要的出口创汇养殖种类。
然而伴随真鲷养殖业的扩大, 其病害问题也日渐突出, 给真鲷的养殖产业带来巨大的损失。
为解决水产养殖的病害问题, 增强养殖品种抗病力, 开发新型水产药物,
我们采用同源克隆的策略, 对真鲷的肿瘤坏死因子（TNFα）基因进行克隆,
并对其表达调控规律进行了初步探索。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 实验鱼
实验用鱼均为购自山东省青岛市南山市场的健康成鱼, 体重约700
g, 于流水实验槽中控温暂养一周。 暂养期间水温控制在(22±2) ℃,
溶氧约6 mg/L, 每日投喂约占体重1.5%的商品人工配合饵料。
1.2 真鲷总RNA的提取与反转录
用新鲜培养的鳗弧菌（Vibrio
anguillarum）感染暂养后的健康真鲷, 感染剂量约108个细菌/kg鱼。
24 h后, 以Trizol试剂(Gibco
BRL, Japan)提取感染鱼头肾的总RNA, 并合成cDNA。
1.3 TNFα同源序列的克隆
以感染真鲷头肾cDNA为模板, 以近源物种TNFα基因保守区设计的简并引物dTF（5′-CTC TAC TTC DTC TAC HBC CAV G-3′）和dTR（5′-CAG CTG GAA BAC TNG ACC AAG-3′）（D=G,A,T; H=A,T,C; V=A,C,G; B=G,T,C;
N=A,T,G,C）进行PCR扩增。 反应体系为: 5 μL 10×PCR反应缓冲液、 3 μL
25 mmol/L MgCl2、 2 μL 2.5 mmol/L dNTP、 10 nmol/L引物dTF和dTR各2
μL、 Taq酶1.25
u, 用PCR水将反应体系补充至50 μL。
反应条件为: 1个循环, 94 ℃变性5
min; 35个循环, 94 ℃变性45 s, 56 ℃退火45
s, 72 ℃延伸45 s; 1个循环, 72 ℃延伸10
min; 4 ℃保温。 PCR产物经纯化后, 连入pMD18-T载体（TaKaRa, 大连）,
转化到大肠杆菌XL1-blue感受态细胞中。 转化子经PCR筛选后, 用ABI
377 DNA自动测序仪测序。
1.4 RACE PCR克隆TNFα的全长cDNA
3′末端克隆:
以接头引物dT（5′-GGC
CAC GCG TCG ACT AGT ACT17-3′）, 引导反转录合成cDNA。 用接头通用引物(5′-GGC
CAC GCG TCG ACT AGT AC-3′)和基因特异性引物TFF1（5′-CAG CCA GGC GTC CTT CAG AG-3′）/ TFF（5′-GAG GTC GGC GTG CCA GAA CA-3′）, 采用半巢式PCR（semi-nested PCR）, 扩增基因3′末端。 应用Touch down的PCR程序:
1个循环, 94 ℃、 5 min; 10个循环:
94 ℃、 45 s, 66 ℃、 30 s (每一循环退火温度降低0.6
℃), 72℃、 1 min; 25个循环:
94 ℃、 45 s, 60 ℃、 30 s, 72 ℃、
1 min; 1个循环, 72 ℃、 10 min; 4 ℃保温。
5′末端扩增: 以寡聚dT为引物, 用Super-Script
II (Gibco BRL, Japan) 反转录酶启动反转录。 合成的cDNA经纯化后, 用末端转移酶（TdT）（Promega, USA）在新合成的cDNA末端加上poly
C尾。 以上述dC-cDNA为模板, 用接头引物dG（5′-GGC
CAC GCG TCG ACT AGT ACG10-3′）和基因特异性引物TR1（5′-CAG
CCA CAA GCG TTA TCT CC-3′）/ TR2（5′-CTT
TGT GTC CTC ACT GTC AG-3′）扩增序列的5′末端。 反应条件与3′末端扩增相似。
将3′和5′端的扩增片段克隆到pMD18-T载体上, 转化子经PCR筛选后进行序列测定。
1.5 表达研究
分别提取健康及经鳗弧菌感染24 h真鲷的血液、大脑、鳃、心脏、头肾、肾脏、肝脏、肌肉、脾脏等器官或组织的总RNA并合成cDNA。 用引物肌动蛋白-F（actin-F）（5′-ATC
GTG GGG CGC CCC AGG CAC C-3′）和肌动蛋白-R（actin-R）（5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′）扩增的β–肌动蛋白（β-actin）为内参照, 调整各样品模板浓度。
在相同模板量的前提下, 用真鲷TNFα特异性基因引物TFF和TR2对样品进行扩增,
采用RT-PCR方法, 检测TNF基因在不同组织、器官及在病原刺激前后的表达。
1.6 序列分析
扩增序列同源性比对和相似性搜索用BLAST[16]软件进行; 多序列联配采用Clustal[17]程序;
以BLAST2[18]软件进行序列拼接; 模体用InterPro[19]软件查找; 信号肽查找用SingalP[20]程序分析; 跨膜区用TargetP[21]程序搜寻; 采用ClustalW程序和MEGA 2.1[22]软件, 以邻位相联法（neighbor-joining）构建进化树。
2 结果（Results）
2.1 真鲷TNFα同源片段的克隆
采用同源克隆的策略,
以简并引物dTF和dTR对经鳗弧菌感染真鲷头肾的cDNA进行扩增, 获得256
bp的PCR扩增片段, 经BLAST软件分析, 表明该片段与GenBank已知的多个TNF序列有很高的相似性,
E<10－10, 尤其与多个鱼类TNFα序列有极高的相似性,
E<10－15 (结果未显示)。
2.2 真鲷TNFα全cDNA编码序列的克隆
根据获得的真鲷TNF（RS TNF）基因部分序列,
设计特异性引物TFF1和TFF, 与通用引物进行半巢式PCR,
获得了675 bp 3′末端扩增片段, 该序列包含预测编码蛋白质的终止密码子TAA; 5个ATTTA结构, 为mRNA不稳定模体; 三个TNFα基因特有的内毒素应答序列, 其中两个为TTATTTAT结构, 一个为ATATTTAT结构; 在序列的3′末端中, 未发现序列的Poly
A加尾信号序列AATAAA。
以接头引物dG和基因特异性引物TR1和TR2进行半巢式PCR, 获得了786
bp的5′末端扩增片段, 该扩增片段包含序列的起始密码子AUG (Met), 和84 bp的5′非编码区调控序列。
将上述获得的三条序列以BLAST 2软件拼接, 获得了1264
bp RS TNFα基因全cDNA编码序列(GenBank 登录号为AY314010)
（图1）。
该序列包含666 bp可读框（open reading frame, ORF）, 可编码222个氨基酸的RS TNF前体蛋白质。 蛋白质预测分子量约为24.38 kD, 等电点约为5.38。
Fig.1 Schematic diagram showing the
overlapping of cloned TNFα fragments and the positions
of primers used in TNFα gene cloning
RS TNFα的预测蛋白质缺乏糖基化位点, 无信号肽结构, 有明显的跨膜域, 位于S5～G27; 应用InterPro软件分析显示, 该蛋白质属于II型膜蛋白, 含TNF2
分布, 位于A65～L222,
且包含IvIpqtGLYFVysQasF, 符合TNF家族的标签序列模式(signature
pattern) [ILV]-x-[LIVM]-x(3)-G-[LIVMF]-Y-[LIVMFY]2-x(2)-[QEKHL]-
[LIVMGT]-x-[LIVMFY]; 以及一个粘多糖结合位点（SGXG）和细胞粘附序列(cell attachment sequence) (RGD); RS TNFα前体蛋白质含有TNFα转换酶（TNFα converting enzyme）切点, 位于T55/L56R57,
经TNFα转换酶消化, 可产生分子量约19.7
kD的成熟肽[23], 如图2所示。 真鲷TNF基因的编码蛋白质与其他鱼类TNFα有很高的相似性（表1）, 尤其与鲷科的金头鲷（Gilthead
seabream）的相似性高达91％, 与其他鱼类的相似性从33％到67％不等;
与哺乳类的TNFα或TNFβ也有很高的相似性,
RS TNF与哺乳类TNFβ的相似性(34%～35％)高于TNFα的相似性（25%～31％）。
|
Fig.2 The full The letters in shadow included the |
Table
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
进化树分析表明,
真鲷TNFα与其他鱼类TNFα集成一束,
它们与高等动物TNFα和TNFβ源于共同的祖先,
但分别处于进化上不同的分支（图3）。
RS TNFα与金头鲷(Gilthead seabream)的亲缘关系最近, 其次是牙鲆(flounder)、虹鳟(rainbow trout), 溪鳟(brook trout)等鲑科鱼类, 而与鲤鱼(carp)及沟鲶（catfish）等鲤形目和鲶形目鱼类关系较远。
Fig.3 Phylogenetic tree showing the
relationship among the full-length RS TNFα
amino acids sequence with other animals TNFα and TNFβ
The
sequences were aligned by ClustalW program and the phylogenetic tree was
constructed by neighbor-joining methods within MEGA version 2.1.
2.3 真鲷TNFα基因的表达
应用RT-PCR技术, 对真鲷TNFα的组织分布及转录表达进行检测。 结果表明,
真鲷TNFα在未经诱导的正常鱼体的部分组织中也有表达, 如头肾、肾脏和肝脏等器官中均检测到TNFα基因的表达。 但是, 在病原刺激下, 该基因的转录表达明显加强,
表现为表达该基因的组织显著增多, 许多在正常组没有表达的组织, 也可检测到TNFα基因的表达, 如心脏、 肾脏、 肌肉, 甚至在大脑中都可检测到该基因的表达, 如图（4） 所示。
Fig.4 RT-PCR to analyze the tissues expression
and distribution of RS TNFα
3 讨论(Discussion)
TNF在参与高等动物的免疫调控、信号转导、诱导细胞凋亡以及抗肿瘤等方面的活性已得到广泛证明。 研究鱼类和其他低等动物的TNF,
对阐明其免疫机制, 提高机体抗病力, 开发新型水产药物有重要的作用。
本研究采用同源克隆的策略,
在真鲷中获得了1264 bp的RS TNFα全长cDNA编码序列。 序列分析显示, RS TNF cDNA及其预测的氨基酸序列与鱼类TNFα有较高的相似性,
其相似性在不同种类的鱼中有很大差异, 这种相似性的差异与鱼类本身的分类地位有关, 真鲷与金头鲷同属鲷科鱼类, 其亲缘关系最近,
而与鲶形目和鲤形目鱼TNF的差距较大。 有意思的是, 虽然真鲷与金头鲷TNFα的相似性很高,
但是, 它们与哺乳类TNFα和TNFβ蛋白质间的相似性方面却有所区别。 金头鲷TNFα与哺乳类TNFα的相似性高于TNFβ, 约为41.1%～48.6%[12]; 而真鲷与哺乳类TNFβ的相似性高于TNFα,
约为34%～35％;
牙鲆、虹鳟等鱼的TNF氨基酸序列与哺乳类TNFα和TNFβ的相似性相近[9～11]。
进化树分析表明, 鱼类TNF与哺乳类TNFα和TNFβ起源于共同的祖先,
但分别处于不同的进化分支, 哺乳类TNFα与TNFβ是在鱼类与哺乳类分化后才由TNF中特化出的[9,24];
RS TNFα与哺乳类TNFα相似, 属II型膜蛋白, 序列中含有一个TNF2分布结构和TNF家族的标签序列,
序列及进化树分析表明该基因属于TNF家族成员。
结构分析显示,
真鲷TNF与哺乳类TNFα相似,
有一明显的跨膜域, 属于膜结合蛋白; 而哺乳类TNFβ是一种分泌型蛋白质, 不具有跨膜域[3]。
真鲷TNF具有一个较保守的TNFα转换酶切点,
经TNFα转换酶消化后可释放成熟肽; TNFβ则具有信号肽,
信号肽被切除后可释放成熟肽。 真鲷TNF基因预测蛋白质的成熟肽区域, 无糖基化位点,
有一对结构上保守的二硫键, 它们在形成蛋白质二级结构中发挥重要的作用; TNFβ则缺乏二硫键结构[3,4]。 从表达研究结果看, 真鲷TNF
基因可以在多种组织和器官中表达, 而TNFβ仅能在巨嗜细胞等少数几种与免疫相关细胞中表达。 因此, 虽然真鲷TNF与哺乳类TNFβ的相似性高于TNFα,
但是根据基因结构及其组织表达分析结果, 可以证明该基因是TNFα,
而非TNFβ。
表达研究结果表明,
真鲷TNFα存在组成型和诱导型表达两种表达方式。 在部分未经刺激的组织中,
真鲷TNFα基因可以正常表达, 但是经病原刺激后,
其基因表达的组织分布显著增多。 这与金头鲷、虹鳟和牙鲆TNFα基因的表达结果都有所不同, 在金头鲷中TNFα基因可以在所有未刺激的组织中呈组成型表达, 病原刺激并不增加组织的表达量[12]。 而在虹鳟和牙鲆中, 只有诱导型表达而没有组成型表达[9,10]。 真鲷TNFα基因多器官表达与它在机体内的作用地位相关, 在哺乳类动物中, TNFα不仅广泛参与机体抗感染免疫, 而且具有协调机体特异性和非特异性免疫的能力, 以及调控神经免疫系统等多种作用。
真鲷TNFα基因的cDNA序列中有三个内毒素应答序列和多个mRNA不稳定模体, 这些模体在调控TNFα的产生以及炎症应答上有重要的作用[25～27]。
该基因推导的氨基酸序列中包含有TNF家族的标签序列以及粘多糖粘附位点(SGXG)和细胞粘附序列(RGD), 这些结构与TNFα参与机体炎症应答反应及信号转导等功能有密切的关系。 由表达研究结果看,
经病原刺激后, TNFα在机体内的转录表达显著增高。 上述结果表明,
真鲷TNFα基因在参与机体抗感染免疫中有重要的作用。
鱼类TNF的作用机制以及在鱼体的生物学效应, 目前还不清楚, 这有待于日后对其基因的重组以及活性鉴定来确定其应用及开发价值。
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