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Effects
of Sodium Selenite on Telomerase Activity and Telomere Length
LIU Qiong*, WANG Hong, HU De-Cong, DING
Chao-Jian, XIAO Heng, XU Hui-Bi, SHU Bai-Hua1, XU Shun-Qing1
( Department of Chemistry, Huazhong
University of Science and Technology, Wuhan 430074, China; 1 Institute of
Environmental Medicine, Tongji Medical College, Wuhan 430030, China )
Abstract To
study the biological basis of selenium in resisting senescence through its
effects on cellular telomerase activity and telomere length. In the
experiments, the cell line of hepatocytes L-02 was divided into three groups
supplemented with sodium selenite at final concentrations of 0, 0.5 and 2.5 μmol/L, respectively. Cellular telomerase
activity was measured by telomeric repeat amplification protocol and enzymatic
luminometric inorganic pyrophosphate detection assay. RT-PCR was used to
semi-quantitatively detect human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene
expression. The change of telomere length was assayed through flow cytometry
and fluorescence in situ hybridization. Results showed that L-02 cells had low
telomerase activity and hTERT gene expression level when cultured in the normal
way. The cells grew well after 3-week-cultivation in the media supplemented
with 0.5 or 2.5 μmol/L sodium selenite.
Besides, sodium selenite significantly increased cellular telomerase activity
and hTERT gene expression level. The telomere length of L-02 cells was also
extended after 4-week-cultivation with sodium selenite. Thus, sodium selenite
at nutritional doses could prolong the life span of hepatocytes L-02 through
increasing telomerase activity and telomere length. This result provides a
possible mechanism for explaining the anti-senescence function of selenium.
Key
words sodium selenite; telomerase
activity; human telomerase reverse transcriptase; telomere length; senescence
_________________________________________________
Received:
July 15, 2003 Accepted:
September 26, 2003
This
work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation
of China (No. 30170903) and the Project for Excellent Young Teacher from
Chinese Education Ministry (No. 40, 2002)
*
Corresponding author: Tel, 86-27-87543532; Fax, 86-27-87543632; e-mail, [email protected]
亚硒酸钠对肝细胞L-02端粒酶活性和端粒长度的作用
刘琼* 王红 胡德聪 丁朝建 肖恒 徐辉碧 舒柏华1 徐顺清1
(华中科技大学化学系,
武汉430074; 1同济医学院环境医学研究所, 武汉430030)
摘要 通过研究硒对端粒酶活性和端粒长度的作用, 探讨硒抗衰老的生物学机制。 实验以人肝细胞株L-02为研究对象, 分别补充0.5和2.5 μmol/L亚硒酸钠, 采用端粒重复序列扩增–焦磷酸根酶联发光法、 逆转录聚合酶链式反应法及流式荧光原位杂交法, 分别检测细胞的端粒酶活性、
人端粒酶逆转录酶催化亚基基因（hTERT）的表达及端粒长度的变化。 结果表明:
常规培养的肝细胞株L-02的端粒酶活性和hTERT基因表达水平均较低。
补充0.5和2.5 μmol/L亚硒酸钠三周后细胞生长状况良好、端粒酶活性和hTERT基因表达水平显著性增高, 且呈一定的剂量–效应关系。 细胞补充亚硒酸钠四周后端粒长度显著增长。 说明营养浓度的亚硒酸钠可通过提高端粒酶活性和增长端粒长度来减缓L-02肝细胞衰老、延长细胞寿命。
关键词 亚硒酸钠; 端粒酶; 端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT);
端粒; 衰老
微量元素硒具有抗衰老功能。
通常认为其机理与硒在体内的抗氧化作用相关联[1]。
细胞衰老受端粒长度的控制。 端粒是真核细胞线性染色体末端特殊的DNA-蛋白质结构。 在人类和其他脊椎动物中为(TTAGGG)n重复序列, 其重复次数约为2000次[2,3]。 人正常体细胞的端粒随细胞分裂而每次缩短30～200 bp。 当端粒缩短达到一个临界长度, 细胞染色体即失去稳定性,
细胞发生衰老或凋亡[4,5]。
除正常的DNA复制端粒缩短外, 氧化应激加速端粒缩短,
而抗氧化剂则减缓端粒缩短[6,7]。
端粒缩短是细胞衰老的标志, 减缓端粒缩短的速度是防止衰老的重要手段[6]。
端粒酶是一种具有逆转录酶功能的核糖核蛋白DNA聚合酶,
是RNA-蛋白质复合物, 包括一条RNA链和两条多肽链[8], 能够以自身内在的RNA为模板合成端粒片段[9], 从而弥补了细胞分裂时端粒的丢失, 维持端粒长度, 保持染色体的动态平衡[10]。 端粒酶复合物由六个亚基组成, 其中比较重要的三个亚基为:
人端粒酶RNA (hTR), 端粒酶结合蛋白1(TEP1)和人端粒酶逆转录酶（hTERT）。
在约84%～95%恶性肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性, 而良性肿瘤及正常组织中该活性的检出率只有4%左右[11,12]。 在一些永生化细胞株及生殖细胞、 造血干细胞、 胚胎细胞、 淋巴细胞、 皮肤表皮细胞、 内皮细胞等细胞中端粒酶被活化并催化端粒延长、 维持端粒的正常功能、
抑制细胞衰老或使细胞永生化[13,14]。
这表明端粒酶本身并不是致癌的, 而且在正常人体细胞中适当地激活端粒酶活性可以延长细胞的寿命达到抗衰老的作用。
本文以人肝细胞L-02为研究对象, 通过对细胞补充营养剂量的亚硒酸钠, 研究硒对端粒酶和端粒的作用, 探讨硒抗衰老的生物学机制。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 试剂与仪器
人肝细胞株L-02购于武汉大学细胞贮存中心。 RPMI 1640 培养基、 Trizol试剂等购于美国Gibco
BRL公司。 牛血清白蛋白（BSA）, 聚乙烯吡咯烷酮(PVP,
分子量360 000), 腺苷脱氨基酶（ADA）、 腺苷-5′–磷硫酸盐（adenosine-5′-phosphosulfate）和ATP-硫酸化酶均购于美国Sigma公司。 Taq DNA聚合酶、荧光素、荧光素酶和Moloney鼠白血病病毒反转录酶(MMLV反转录酶)均购于美国Promega公司。 三磷酸脱氧核苷（dNTP）购于英国Roche公司。 所有引物由上海生工生物技术公司合成。 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的(C3TA2)3端粒DNA序列特异性肽核酸(PNA)探针[FITC-(C3TA2)3
PNA probe]购于大连TaKaRa生物技术公司。 其余化学试剂均为国产分析纯试剂。
Lambda Bio 4.0紫外可见分光光度仪为美国Perkin Elmer公司产品, Amplitron II PCR仪为美国Barnstead/Thermolyne公司生产, BPCL微弱发光仪由中科院生物物理所生产, FACSort流式细胞仪为美国B.D.公司产品。
1.2 细胞培养
人肝细胞L-02常规培养于含10％新生小牛血清、
100 IU/mL青霉素、 100 μg/mL链霉素和0.25
IU/mL胰岛素的RPMI 1640完全培养液中。 培养条件为37 ℃和5％
CO2。 将上述细胞分为三组:
（1）正常对照组;（2）培养基中补充终浓度为0.5 μmol/L
亚硒酸钠组;（3）补充2.5
μmol/L亚硒酸钠组。 细胞培养3周后收获用于端粒酶活性和hTERT基因表达水平的检测;补硒四周后的细胞用于检测端粒长度的变化。
1.3 端粒重复序列扩增–焦磷酸根酶联发光法（TRAP-ELIDA）检测端粒酶活性[15]
将补硒三周生长状况良好的细胞用0.25%胰酶消化后, 用冰冷的0.9% NaCl生理盐水洗两次。 再加入定量体积的生理盐水配成细胞悬液, 台盼蓝染色法计数细胞, 活细胞占总细胞的比例大于98%。
取含2×106个细胞的悬液,
1000 r/min室温离心获得沉降的细胞, 向其中加入200 μL
CHAPS裂解液[13], 冰上反应30 min, 离心取上清液,
测定总蛋白质含量, 调节蛋白质浓度为2 g/L。 取所得上清液1.0 μL,
加入TRAP缓冲液[13]、dNTP和TS 引物
(5′-AAT CCG TCG AGC AGA GTT-3′), 使终体积为25
μL。
将混合物于30 ℃反应30 min, 然后于90
℃加热3 min。
再加入CX引物 (5′-CCC
TTA CCC TTA CCC TTA CCC TAA-3′) 和Taq DNA聚合酶,
在PCR仪上于94 ℃、30
s, 55 ℃、40 s, 72 ℃、1 min, 循环33次;最后于72
℃延伸 2 min。
然后向混合物中加入2 μg ADA, 于37
℃培养30 min, 再将其于90 ℃加热4
min, 以使ADA失活。 反应产物稀释5倍, 取2
μL加入到95 μL
ELIDA混合物中。 在室温下于BPCL微弱发光仪上记录前6 s的发光点数。 ELIDA混合物含有0.1 mol/L Tris-乙酸盐、 2 mmol/L EDTA、 10 mmol/L 乙酸镁、
0.1% BSA、 1 mmol/L 二硫代苏糖醇、 0.4 g/L PVP、 5 mg/L 荧光素、
5 μmol/L 腺苷-5′–磷硫酸盐、 66 IU/L ATP-硫酸化酶和4 mg/L荧光素酶。 混合物中焦磷酸根(PPi)的摩尔数等于用荧光素酶系统检出的ATP量。 设1
μg端粒重复序列等于3.24 nmol核苷,
则ELIDA混合物中1 pmol的PPi来源于310 pg端粒重复序列的延长[15]。
端粒酶活性用pg DNA/μg蛋白质表示。
1.4 逆转录–聚合酶链式反应（RT-PCR）检测hTERT基因的表达[16,17]
从补硒三周、生长状况良好的细胞中分取含1×105个细胞的悬液, 置3.5
cm 的培养皿中培养过夜后, 吸去培养介质, 向含贴壁细胞的培养皿中加入1 mL Trizol试剂, 根据试剂使用说明书提取细胞总RNA, 计算总RNA含量。 所得样品的A260/A280比值均在1.8～2.0之间。 参照文献[18]设计扩增hTERT基因的引物寡核苷酸序列如下: 上游引物为5′-CGG AAG AGT GTC TGG AGC AA-3′, 下游引物为5′-GGA TGA AGC GGA GTC TGG A-3′。
扩增片段长度为145 bp。
扩增内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因的上游引物为5′-ACA
GTC CAT GCC ATC ACT GCC-3′, 下游引物为5′-GCC
TGC TTC ACC ACC TTC TTG-3′, 扩增片段长度为268 bp。 取2 μg细胞总RNA, 加入MMLV逆转录酶缓冲液(pH 8.3)、MMLV逆转录酶、dNTPs、hTERT基因和内参照基因的下游引物, 用DEPC处理的三次蒸馏水调节反应体积为20 μL。
于37 ℃温育60 min后,
95 ℃加热5 min。
合成的cDNA贮存于－20 ℃。 取自100 ng 总RNA逆转录所得的cDNA, 加入PCR反应缓冲液、hTERT基因或内参照基因的上下游引物以及Taq DNA聚合酶, 用三蒸水调节体积为30 μL,
94 ℃加热3 min后进行PCR循环。 条件: 94 ℃、30
s,62 ℃、45 s,72 ℃、1 min, 循环42次以扩增hTERT基因片段,
循环32次以扩增GAPDH基因片段;最后于72 ℃延伸5
min。 PCR产物于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中进行电泳,
拍照后用PhotoCapt图象分析软件分别算出hTERT mRNA和GAPDH
mRNA的峰体积, 以二者的比值表示hTERT mRNA水平。
1.5 流式荧光原位杂交法（Flow-Fish）检测端粒长度的变化[19,20]
取补硒四周生长状况良好的5×105 细胞悬液,
置1.5 mL EP管中, 离心去培养介质,
将细胞重新悬浮于100 μL 杂交液中[19],
加入FITC-(C3TA2)3 PNA探针。阴性对照组以相同体积的三蒸水代替FITC-(C3TA2)3 PNA探针。 将样品变性后置暗处室温杂交2 h。
之后, 细胞用洗液1洗两次,
洗液2洗一次。 洗液1含有70%去离子甲酰胺、10
mmol/L Tris-HCl、0.1% BSA 和Tween-20。 洗液2为含有0.1%
BSA 和Tween-20的PBS。 将细胞重悬于300 μL含碘化丙锭（PI）的磷酸缓冲液中,
于4 ℃下放置过夜, 于FACSort流式细胞仪上, 由FL-2通道测定PI 荧光强度,
FL-1通道测定端粒FITC 线形范围内的荧光强度。 为进行数据分析,
细胞控制为单一二倍体细胞。 端粒平均荧光强度表示与FITC-(C3TA2)3
PNA探针杂交细胞的平均荧光强度减去无探针杂交细胞的平均荧光强度。 端粒长度与端粒平均荧光强度成正比[19～21], 因此用端粒平均荧光强度检测端粒长度的变化。
2 结果(Results)
2.1 亚硒酸钠提高肝细胞株L-02端粒酶的活性
TRAP反应产物有两种:
（1）端粒重复序列PCR扩增产生的双链DNA;（2）端粒酶延长反应及PCR扩增的副产物PPi。 端粒酶延长反应产生的PPi数量远小于PCR扩增产生的, 可以忽略不计。 在PCR扩增中,
随着一个核苷酸参入DNA, 一个PPi被释放。 PCR扩增中释放的PPi数量和TRAP产生的DNA数量成比例。 因此可通过测定TRAP反应中PPi的数量来测定端粒酶活性[15]。
PPi含量的测定采用ELIDA法进行。 PPi在ATP-硫酸化酶的催化下与该酶底物腺苷-5′–磷硫酸盐反应, 生成ATP。
ATP与荧光素在荧光素酶催化下发光, 由微弱发光仪检测并记录前6 s内的发光点数。 图1为焦磷酸钠酶联发光值标准曲线。
当PPi含量在0～0.15
μmol/L范围内时, 体系发光值与PPi含量成线性关系。
Fig.1 The calibration curve of
luminescence versus pyrophosphate content
在人肝细胞L-02的培养介质中分别补充终浓度为0.5 和2.5
μmol/L亚硒酸钠3周后,
对各细胞提取液采用TRAP-ELIDA法测定反应产物中PPi含量。 图2表明:
各组细胞提取液的发光值随培养介质中亚硒酸钠浓度的不同而显著不同。 与不加硒的对照组相比,
补硒细胞提取液的发光值显著性增高（P<0.01）, 而且随着硒浓度的增大,
发光值增大。 根据焦磷酸钠酶联发光值标准曲线（图1）,
将各细胞提取液的发光值换算成端粒酶活性, 则补充0.0, 0.5 和2.5
μmol/L亚硒酸钠的细胞端粒酶活性分别为(0.0±34.8),
(163.6±40.9)和(350.1±32.8)
ng DNA/μg 蛋白质。 对照组肝细胞L-02的端粒酶活性较低, 而补充亚硒酸钠的细胞,
端粒酶活性显著增大, 且呈一定的剂量–效应关系。
Fig.2 Effects of sodium selenite on
telomerase activities in human hepatocytes L-02 detected by TRAP-ELIDA method
The
counts of bioluminescence were measured in 6 seconds. Results are expressed as
x-±s(n=5). **P<0.01 vs. group
0 μmol/L selenium; # P< 0.05
vs. group 0.5 μmol/L selenium.
2.2 亚硒酸钠促进肝细胞株L-02中hTERT表达
采用RT-PCR法对肝细胞株L-02中hTERT基因的表达水平进行检测(图3)。
图3(A)为内参照GAPDH基因的琼脂糖凝胶电泳图。
图3(B)为hTERT基因凝胶电泳图。 在PCR扩增中使用的cDNA模板来源于100 ng总RNA的逆转录产物。 以此剂量的模板进行PCR扩增, 对照组L-02细胞中的hTERT基因的表达在此条件下未被检出, 但当将总RNA量增大5倍后,
对照组细胞中的hTERT基因表达可被检出(未在本文中刊出)。
补充0.5 和2.5 μmol/L浓度亚硒酸钠的L-02细胞,
hTERT基因表达水平显著性增高, 使其在100 ng总RNA的模板量下已能被检出[图3(B)]。
Fig.3 Effects of sodium selenite on
the mRNA expression of hTERT gene measured semi-quantitatively by RT-PCR method
(A) GAPDH gene. (B) hTERT gene. 1,
negative control; 2－4,
L-02 cells at selenium concentrations of 0, 0.5, 2.5 μmol/L
respectively; 5, DNA marker with bands of 657, 458, 434, 328, 289, 267, 174,
142, and 102 bp from up to down.
为半定量分析硒对L-02细胞内hTERT基因表达的影响,
以hTERT mRNA峰体积对GAPDH mRNA峰体积的比值表示hTERT基因表达水平, 结果示于图4。 补充0.5
和2.5 μmol/L亚硒酸钠的细胞与未补硒的对照组相比, hTERT基因表达水平显著性提高(P<0.01), 且呈一定的剂量–效应关系。
Fig.4 Effects of sodium selenite on
the mRNA expressions of hTERT gene in human hepatocytes L-02
The
value is presented as the ratio between the target mRNA and the corresponding
GAPDH mRNA. Data are expressed as x-±s
(n=4). ** P<0.01 vs. group 0 μmol/L selenium; ##
P<0.01 vs. group 0.5 μmol/L selenium.
2.3 亚硒酸钠促进肝细胞株L-02端粒的延长
Flow-Fish法检测细胞端粒长度变化的原理在于细胞端粒由高度重复序列T2AG3组成,
其长度越长, 所含重复序列数目越多, 所结合的FITC-(C3TA2)3
PNA探针就越多, 其荧光也就越强[22]。 因此对同一种细胞而言, Flow-Fish法检测的单个细胞端粒平均荧光强度与端粒长度成正比。 肝细胞L-02的荧光直方图见图5(A)。
基于PI荧光和前向散射光(FSC)而控制检测细胞在R1区(即二倍体细胞区),
测定该区细胞端粒特异性的FITC荧光[图5(B)]。
端粒平均荧光为与FITC-(C3TA2)3 PNA探针杂交的细胞的平均荧光减去阴性对照细胞(即与不含探针杂交液作用的细胞)的平均荧光的差值。
Fig.5 Flow FISH analysis of human
hepatocytes L-02
(A) The histogram of cells gated on
region 1 (R1) on the basis of propidium iodide (PI) fluorescence and forward
light scatter (FSC) to measure the telomere (FITC) fluorescence. (B) The
telomere fluorescence of cells.
由图6可知, 在人肝细胞L-02培养基中分别加入0.5和2.5
μmol/L亚硒酸钠, 细胞端粒平均荧光强度与不加硒的细胞相比有明显提高(P<0.05), 而且呈一定的剂量–效应关系。 说明补充亚硒酸钠能促进细胞端粒的延长。
Fig.6 Effects of sodium selenite on
telomere fluorescence intensity in human hepatocytes L-02
FITC fluorescence is expressed as x-±s (n=3). * P<0.05 vs. group 0 μmol/L selenium; # P<0.05 vs. group 0.5 μmol/L selenium.
3 讨论
(Discussion)
营养剂量的硒在体内的重要功能是抗氧化。
硒可通过清除机体中产生的活性氧自由基, 保护生物大分子免受氧化损伤; 也可以谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白还原酶的形式, 调节体内重要的氧化还原体系――谷胱甘肽系统和硫氧还蛋白系统, 以保持细胞的氧化还原平衡;
此外, 硒还可以通过形成其他硒酶或硒蛋白, 如硒蛋白P和硒蛋白W等,利用硒蛋白中的硒代半胱氨酸残基来直接调节细胞的氧化还原状态[23]。 近年研究发现: 细胞的氧化还原状态与端粒缩短和细胞衰老相关联。
一系列致氧化应激条件如: 辐射、 氧化剂处理、 慢性轻微型组织内氧过多等,
均能诱导类似于衰老的早期细胞静止[7], 或通过致基因组DNA损伤来加速细胞端粒缩短。
硒作为调节细胞氧化还原状态的重要生物微量元素, 其与端粒的作用至今报道甚少, 仅发现硒能延长或维持酵母端粒长度[24]。 本文结果表明:
在肝细胞株L-02中端粒酶活性和hTERT基因表达水平均较低,
补充营养剂量硒能显著性促进L-02细胞端粒酶活性和hTERT基因表达,
延长细胞端粒长度。 有关硒的作用机理目前尚不清楚, 它可能与硒在体内作为抗氧化剂的功能相关联。 硒可通过抗氧化来保护端粒免受损伤, 并维持端粒酶活性。
有关衰老和端粒酶的研究表明: 端粒酶阴性细胞的增殖引起端粒缩短, 并最终导致细胞衰老和死亡。 相反人体永生性细胞,
如生殖细胞、造血干细胞和许多细胞株, 由于其端粒酶阳性而阻止端粒的缩短并使“有丝分裂时钟”重新调整。 正常体细胞中没有端粒酶阳性细胞。
然而, 造血干细胞和外周血中的淋巴细胞具有端粒酶潜能(telomerase competent), 即当这些细胞不分裂或处于静止期时, 细胞呈端粒酶阴性;当进行细胞增殖时,
细胞呈端粒酶阳性[25]。
其他细胞如皮肤角质细胞、肠腺上皮细胞以及内膜上皮细胞也都有端粒酶潜能。 肝细胞株L-02为永生性细胞, 在常规培养下该细胞呈现较低的端粒酶活性, 而补充营养剂量硒则使细胞增殖速度加快, 细胞端粒酶活性显著性增高, 端粒长度增长。 微量元素硒因此可延长细胞寿命、具有抗衰老的功能。 除对永生性的肝细胞株L-02发生作用外, 硒对生物体内正常肝细胞的端粒酶活性或hTERT基因表达水平是否有作用？这有待进一步研究。
_________________________________
感谢华中科技大学药物研究所杨祥良教授和生命科学院徐涛教授对本研究在立项讨论和仪器使用上给予的帮助。
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at: 2003-12-16