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Cloning,
Eukaryotic Expression and Function Assay of Recombinant Leukemia Inhibitory
Factor Gene LIF
NING
Hong-Xiu, CHEN Yue, RONG Yu, ZHANG Xiu-Fang, CHANG Zhi-Jie*
( Department of Biological Sciences and
Biotechnology, Tsinghua University, Beijing 100084, China)
Abstract Leukemia inhibitory factor
(LIF), a cytokine belonging to IL-6 family, which was discovered to inhibit the
proliferation of murine myeloid leukemic cell line M1, has multiple functions
in various biological processes. This factor is highly glycosylated when it
binds to receptor to activate the signal transduction. Therefore, expression of
LIF through eukaryotic system is the best way to obtain the correct
glycosylation. In this study, human LIF cDNA with the sequence of signal
peptide was cloned from adult blood cells by RT-PCR, and then subcloned into
pcDNA3 for expression in HEK-293T cells. After transfection of the recombinant
plasmid pcDNA3/LIF into HEK-293T cells, the conditioned medium containing the
secreted LIF was obtained. The activity of the secreted LIF in the conditioned
medium was detected through the phosphorylation of STAT3, EMSA and luciferase
reporter (pGL2-APRE-luc) assays in Hep3B and 293T cells. Furthermore, to
investigate the biological functions of the overexpressed recombinant LIF, a
[3H]-thymedine incorporation assay was performed, and the results showed that
the recombinant LIF inhibited the growth of M1 cells strongly. Taken together,
all the function assays suggest that the recombinant LIF has the normal
functions, suggesting that the recombinant LIF could be used for further
studies.
Key
words LIF; cloning; expression;
function assay
______________________________________________
Received:
July 22, 2003 Accepted:
September 10, 2003
This
work was supported by the grants from the National Natural Science Foundation
of China (No. 39970369, No. 30070703) and 985 Program of Tsinghua University
*Corresponding
author: Tel, 86-10-62785076; e-mail, [email protected]
人白血病抑制因子基因LIF的克隆、真核表达及活性检测
宁红秀 陈�X 戎煜 张秀芳 常智杰*
( 清华大学生物科学与技术系,
北京 100084 )
摘要 白血病抑制因子(LIF)是一种多功能细胞因子, 在生物发育及维持正常生理功能中发挥着重要的作用。 以成人血细胞的总RNA为模板, 利用RT-PCR方法从成人外周血细胞中扩增人白血病抑制因子, 而后将其克隆到真核表达载体pcDNA3, 在哺乳动物细胞中成功表达。
将分泌到细胞培养基中的LIF因子收集, 通过LIF信号转导通路下游蛋白质STAT3磷酸化水平的检测、
EMSA实验以及荧光酶报告系统检测, 发现其具有激活STAT3信号通路的生物学活性。
同时, [3H]-TdR参入实验的结果也表明, 所表达LIF因子能显著抑制鼠骨髓白血病细胞系M1的增殖。
关键词 白血病抑制因子(LIF); 克隆; 表达;
功能测定
1987年Gearing等[1]研究发现了LIF(leukemia
inhibitory factor)。 当时因发现该因子具有抑制鼠骨髓白血病细胞系M1细胞的增殖,
促进其分化的作用, 因此被命名为白血病抑制因子――LIF。 随后的研究表明该因子为一种多功能细胞因子, 它不仅能抑制白血病细胞的增殖, 而且对多种细胞的增殖、
分化、 存活以及胚胎发育都具有重要的作用[2]。 同时也有研究指出,
对于哺乳动物的胚胎着床, LIF也具有很重要的作用[3,4] ;对于神经系统的发育及修复,
LIF也是不可缺少的因子[5～9]。 最为重要的是, LIF可以抑制胚胎干细胞的分化。
因此, 在胚胎干细胞的培养过程中,LIF是必须添加的细胞因子。
由于LIF因子为一种高度糖基化的蛋白质, 因此,
利用真核表达系统可以保证其糖基化的修饰。
本研究采用真核表达系统进行LIF因子的表达, 旨在使LIF因子能得到正确的糖基化修饰, 以便得到功能正常的LIF因子。 另外, 我们选用了具有新霉素抗性的表达载体pcDNA3, 可以在哺乳动物细胞中稳定表达LIF因子,
为进一步研究和应用打下了基础。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
人胚肾细胞系HEK-293T为本实验室储存, 鼠骨髓白血病细胞系M1为军事医学科学院沈倍奋院士赠送, 人肝癌细胞系Hep3B细胞为本系陈晔光教授赠送, 真核表达载体pcDNA3及大肠杆菌菌株DH5α为本实验室所有,
pGL2-APRE-luc荧光酶报告质粒为日本大坂医学院Toshio Hirano博士赠送, 质粒pXJ-40-STAT3（STAT3与N端Flag融合表达的真核表达质粒）为新加坡分子与细胞生物学研究所Xinmin CAO博士赠送,
培养细胞所用DMEM培养基、MEM培养基、RPMI
1640培养基及FBS血清购自Gibco BRL公司,
转染试剂TfxTM-20、测定荧光酶活性的细胞裂解液以及荧光酶底物购自Promega公司, LIF抗体、STAT3抗体及STAT3磷酸化的抗体购自Santa
公司, Western 杂交显色底物ECF购自Pharmacia公司, 限制性内切酶购自NEB公司, 其他试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 细胞总RNA的提取及RT-PCR 人外周血细胞总RNA的提取采用Trizol一步法。 以所得到的细胞总RNA为模板,
使用Qiagen公司的One step kit试剂盒进行RT-PCR, 得到包括信号肽在内的LIF基因的cDNA。
RT-PCR反应条件为: 50 ℃、 30 min; 95 ℃、 15 min; 94 ℃、 45 s, 50 ℃、
1 min, 72 ℃、 1 min, 30个循环; 72 ℃、
10 min。 所用引物由上海生工公司合成:上游为5′-GCTAGAATTCCCCATAATGAAGGTCTTG-3′;下游为5′-GATACTC-GAGTCCTGCTAGAAGGCCTG-3′。
1.2.2 重组质粒的构建 用EcoRI和XhoI酶将目的片段以及表达载体pcDNA3双酶切后,
用T4连接酶进行连接。 将连接产物转化入DH5α菌株中进行筛选鉴定。
1.2.3 LIF蛋白的表达及条件培养基的制备 将重组质粒用转染试剂TfxTM-20转染哺乳动物细胞HEK-293T进行表达。 转染后12 h将细胞的完全培养基换为不含血清的培养基, 48 h后, 收集培养基,
即为所得条件培养基。
1.2.4 Western杂交将 转染过LIF重组质粒的HEK-293T细胞以及用条件培养基处理过的Hep3B细胞用细胞裂解液裂解后,
进行SDS-PAGE电泳。 而后转移至硝酸纤维素膜, 进行Western杂交。 最后用Pharmacia公司的PhospherImager检测系统进行Western结果检测。
1.2.5 LIF重组蛋白的活性鉴定
(1)
重组LIF因子对STAT3(信号转导和转录激活因子3)磷酸化作用的检测将人的肝癌细胞系Hep3B以6×105接种量接种于6孔细胞培养板,
而后转染重组质粒pXJ-40-STAT3。
培养24 h后, 将含有LIF因子的条件培养基与对照培养基加入到培养细胞中, 培育30 min后,
收获细胞, 进行SDS-PAGE电泳,
而后进行Western 杂交, 检测STAT3的磷酸化程度。
(2)
重组LIF对STAT3与其DNA结合元件结合的促进作用的检测（EMSA实验）将HEK-293T细胞以7×105个的数量接种于6孔细胞培养板中,
培养24 h后, 用对照培养基以及含有重组LIF因子的条件培养基培育30 min, 而后将细胞裂解,
进行EMSA试验。 具体试验方法参照文献[10]。
所用探针由上海生工公司合成, 序列为: 5′-TCGACATTTCCCGTAAATCGTCGA-3′。
(3)
重组LIF因子对STAT3转录活性激活作用的测定（荧光酶报告实验）用重组质粒pcDNA3/LIF及STAT3荧光酶报告质粒pGL2-APRE-luc共同转染HEK-293T细胞,
用质粒pcDNA3作为阴性对照。 培养48 h后将细胞裂解, 对裂解液进行荧光酶活性测定, 从而检测重组LIF因子对STAT3转录活性的激活作用。
(4)
重组LIF因子对鼠骨髓白血病细胞系M1细胞生长抑制作用的测定利用转染HEK-293T细胞所产生的条件培养基对M1细胞进行[3H]-TdR参入增殖实验。 具体方法为, 将M1细胞以5×105个的数量接种于24孔细胞培养板中,
用含有重组LIF因子的培养基刺激24 h后,
在[3H]-TdR参入前, 对细胞进行无血清饥饿24
h, 而后加入[3H]-TdR以及血清, 培养6
h后, 用特定裂解液将细胞裂解后进行参入测定。
3 结果(Results)
3.1 LIF基因cDNA的克隆及序列分析
提取成人外周血总RNA后, 以RT-PCR的方法扩增得到LIF基因cDNA片段(约606
bp)。 应用EcoRI、XhoI双酶切后,
将该片段克隆到pcDNA3中构建成重组质粒pcDNA3/LIF, 然后进行序列测定分析。 序列测定的结果表明,
本次实验克隆所得到的LIF基因的cDNA与GenBank中所公布的人LIF基因的cDNA完全一致。 RT-PCR产物见图1。
Fig.1 The results of RT-PCR
1,
1 kb ladder DNA marker; 2, negative control; 3, RT-PCR products LIF cDNA.
3.2 重组质粒pcDNA3/LIF的鉴定
重组质粒用EcoRI酶和XhoI酶双酶切消化后,
进行琼脂糖凝胶电泳分析, 结果见图2。 由图中可以看出, 所鉴定克隆均为阳性克隆,
表明我们得到了正确插入LIF cDNA的重组质粒pcDNA3/LIF。
Fig.2 The selection of positive clones
1,
1 kb ladder DNA marker; 2-5, positive clones.
3.3 重组LIF在哺乳动物细胞中的表达
为了检测我们所克隆得到的LIF因子能否在哺乳动物细胞中进行表达, 我们将重组质粒pcDNA3/LIF采用脂质体转染的方法,
转染到HEK-293T细胞中, 同时转染空载体pcDNA3作为阴性对照。 转染完48 h后, 收获细胞进行了Western
杂交检测。 实验结果表明,
重组LIF因子在哺乳动物细胞中进行了表达（图3）。
由于我们克隆所得到的LIF cDNA含有信号肽, 在表达后很快便被分泌到细胞外, 因此用细胞裂解液检测到的表达量偏少。 又因为LIF为一种高度糖基化的蛋白质, 因此实际检测到的LIF大小要比预期的21 kD大,
约为26 kD。
Fig.3 The expression of recombinant
LIF in 293T cells
HEK-293T
cells were transfected with pcDNA3/LIF or pcDNA3 vector. After 48 h culturing,
the cells were lysed and probed to SDS-PAGE for Western blot. M, marker.
3.4 重组LIF对STAT3（信号转导和转录激活因子3）的磷酸化作用
LIF因子发挥作用时,
其与受体亚单位gp190结合, 在IL-6细胞因子家族公用受体gp130的作用下引起JAK2激酶的活化, 从而引起JAK2激酶底物之一的STAT3的磷酸化。 因此, 对STAT3磷酸化的检测也是对LIF蛋白活性检测的一种方法。
Hep3B细胞表达有丰富的IL-6因子家族的受体, 因此在本实验中我们使用了Hep3B细胞来检测STAT3的磷酸化。 实验中, Western 杂交结果表明,
当转染有STAT3的Hep3B细胞用含有表达LIF因子的条件培养基刺激30 min后,
STAT3有很强的磷酸化作用发生, 而对照培养基则没有任何作用（图4）。
这一实验结果说明我们所克隆得到的LIF因子具有很强的使STAT3蛋白磷酸化的作用,
提示所表达LIF可以通过其正常的信号通路发挥作用。
Fig.4 The recombinant LIF
phosphorylates STAT3 in Hep3B cells
Hep3B cells were transfected with the
recombinant plasmid pXJ-40-STAT3. After 24 h culturing, the LIF conditioned
medium or control medium was added for 30 min. Then, the treated cells were
lysed and probed to Western blot for the examination of STAT3 phosphorylation.
3.5 重组LIF对STAT3与其DNA结合元件结合的促进作用
LIF因子通过其受体亚单位gp190发挥作用引起STAT3的磷酸化后,
STAT3便形成STAT3/STAT3同源二聚体或STAT3/STAT1异源二聚体,
而后与其目的基因启动子上特异的DNA序列结合后引起下游基因的转录。 c-fos为STAT3的一个下游目的基因。
因此, 我们采用了c-fos启动子上STAT3的结合元件进行凝胶滞留实验（EMSA）,
来进一步验证重组LIF因子的功能。 实验结果表明, 用含有LIF因子的条件培养基培育HEK-293T细胞后, STAT3和c-fos启动子上的DNA结合元件具有很强的结合能力, 而对照培养基则没有作用（图5）, 从而说明重组LIF因子可以通过STAT3而发挥其正常的功能。
Fig.5 EMSA for STAT3 in HEK-293T cells
treated with LIF conditioned medium
HEK-293T cells were seeded into 6-well
plate with the amount of 5.0×105
cells, after 24 h culturing, the conditioned medium was added. After 30 min
incubation, the cells were lysed and probed to EMSA. The medium collected from
the cells transfected with pcDNA3 as the negative control. 1, free probe; 2,
the mixture of labeled probe and cell lysate treated with control medium; 3,
the mixture of labeled probe and cell lysate treated with LIF conditioned
medium.
3.6 重组LIF对STAT3转录活性的激活作用
LIF激活STAT3磷酸化后, STAT3便可以与其特异性的DNA元件相结合引起下游基因的转录[11]。 因此, 我们进一步用STAT3荧光酶报告系统检测LIF因子的活性。 我们通过瞬时转染的方法, 将重组质粒pcDNA3/LIF及STAT3荧光酶报告系统pGL2-APRE-luc转染至HEK-293T细胞,
随后对其荧光酶活性进行测定。 测定结果见图6。
由图中可以看出, 单纯转染pGL2-APRE-luc或共转染pGL2-APRE-luc和pcDNA3时,
荧光酶活性保持在基础水平, 表明STAT3的转录活性未被激活。
但是, 当共转染重组质粒pcDNA3/LIF和pGL2-APRE-luc时, 荧光酶活性提高了近13倍, 表明所表达的LIF对STAT3转录活性具有强烈的激活作用。
Fig.6 The recombinant LIF stimulated
STAT3 transcription activity
HEK-293T cells were transfected with
plasmids pGL2-APRE-luc, pcDNA3, and pcDNA3/LIF as indicated. After 48 h
culturing, the cells were lysed and luciferase activity was assayed according
to the Promega’s protocol. The results were normalized with internal control
and expressed as x-±s
from three repeats. APRE, pGL2-APRE-luc.
3.7 重组LIF对鼠骨髓白血病细胞系M1生长的抑制作用
白血病抑制因子最为重要的功能是对白血病细胞增殖的抑制作用。 为了研究重组LIF因子对M1细胞生长的抑制作用,
我们采用[3H]-TdR参入法对M1细胞生长情况进行测定,
其结果见图7。
由结果可以看出, 在一般培养情况下, 从24
h开始, M1细胞表现出了较快的生长速率, 而当加入含有LIF因子的条件培养基时, M1细胞基本维持在低生长水平。
结果表明我们所克隆表达得到的重组LIF因子对M1细胞的生长具有很强的抑制作用, 而用空载体pcDNA3所得到的培养基则没有任何抑制作用（P<0.01）。
Fig.7 The recombinant LIF has
inhibition effect on M1 cell growth
M1 cells were cultured with LIF
conditioned medium or control medium for 24 h. After 24 h starvation, [3H]-TdR
was incorporated for 6 h, and then the cells were lysed for [3H]-TdR
incorporation assay. The results were averaged from three repeats, and standard
errors were calculated (P<0.01).
4 讨论(Discussion)
LIF因子为一种多功能的细胞因子, 其功能的多样性便决定了其应用的广泛性。 但是,
LIF因子同时又是一种高度糖基化的蛋白因子, 因此, 利用原核表达系统很难使其得到正确的修饰, 从而影响其实际应用。 本研究利用真核表达载体对LIF因子进行表达, 并且通过测定所表达的LIF因子对STAT3的磷酸化作用,
对STAT3与其DNA结合元件结合的促进作用,
对STAT3信号通路的激活作用, 以及对鼠骨髓白血病细胞M1的增殖抑制, 验证了所得到的重组蛋白质具有正常的生物学功能。
另外, 因所选用的表达载体为有新霉素抗性的真核表达载体, 所以可以用来在哺乳动物细胞中进行稳定细胞系的建立, 从而在哺乳动物细胞中进行LIF基因的稳定表达。 所克隆的LIF cDNA含有信号肽,
因此可以分泌到培养基中获得条件培养基, 这有助于表达的LIF因子的分离纯化。 本研究中所检测到的细胞中LIF的表达不是很强,
可能是因为所表达的LIF因子大多数都分泌到细胞培养基中的缘故。 本研究虽然已经证明克隆所得到的LIF因子具有正常的生物学功能, 含有LIF因子的条件培养基可以用于很多生物学实验中, 但是还有必要进行进一步的蛋白质纯化工艺的探索, 以期获得LIF因子的纯品, 进一步的扩大其应用范围。
目前, 我们正在探索纯化LIF因子的工艺,
同时建立能够稳定表达LIF因子的细胞系。 这样, 便可以简化生产LIF因子的实验步骤及降低其生产成本, 为LIF因子的广泛应用提供进一步的帮助。
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at: 2003-12-16