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The
Immunopotentiation of Human B Lymphocyte Stimulator C-terminal Peptide
TIAN
Rui-Yang, HAN Wei, YU Ying, CHEN Yue, YU Gu-Song, YANG Sheng-Li, GONG Yi*
( Research Center of Biotechnology,
Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences,
Shanghai 200233, China )
Abstract The
cDNA of human B lymphocyte stimulator C-terminal peptide (C-BLyS) was amplified
by nested PCR from cDNA library of human fetal brain. The expression plasmid
pT7450-C-BLyS was constructed and transformed into E. coli BL21 CodonPlus (DE3)
RIL which can recognize many rare codons. The C-BLyS protein was expressed as
inclusion body in E. coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL and the inclusion body of
C-BLyS was denatured and then refolded by dialysis and purified by ion exchange
chromatography. The refolded and purified C-BLyS can specifically bind with
BCMA-Fc, a fusion protein of BLyS receptor and human IgG1 Fc. Furthermore,
C-BLyS is proved to be an effective stimulator in mouse splenocytes
proliferation in vitro and effective immunostimulant in vivo.
Key
words C-BLyS; BCMA;
renaturation; inclusion body
___________________________________________
Received:
August 21, 2003 Accepted:
October 21, 2003
This
work was supported by a grant from the National High Technology Research and
Development Program of China (863 Program)（No.
2001AA215381）
*Corresponding
author: Tel, 86-21-64700892-369; Fax, 86-21-64700244; email, [email protected]
人B淋巴细胞刺激因子C端肽的免疫增强作用
田瑞阳 韩威 俞缨 陈悦 虞谷松 杨胜利 龚毅*
（
中国科学院上海生命科学研究院生物工程研究中心, 上海200233 ）
摘要 用套式PCR从人胎脑cDNA文库中克隆了B淋巴细胞刺激因子C端肽（C-terminal peptide of B lymphocyte
stimulator, C-BLyS）的cDNA。
在大肠杆菌BL21 CodonPlus (DE3) RIL中以包含体形式表达了C-BLyS。 对包含体的复性条件进行了摸索, 建立了C-BLyS的透析复性与纯化方法。 经复性和纯化的C-BLyS可结合其受体B细胞成熟抗原（B
cell maturation antigen, BCMA）–人IgG1 Fc融合蛋白,
刺激体外培养的小鼠脾脏细胞增殖, 并且可明显增强小鼠对溶菌酶的免疫应答水平。
关键词 C-BLyS;
BCMA; 复性; 包含体
BLyS[1], 又名BAFF[2,3]、 THANK[4]、
TALL-1[5]、 zTNF4[6], 是近年来新发现的一种免疫增强因子, BLyS可特异性地结合B淋巴细胞,
对B淋巴细胞的分化、增殖有明显的促进作用, 可增强机体对外来抗原的免疫应答, 在临床治疗中已显示出乐观的应用前景[7]。
BLyS由巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞等骨髓来源的细胞表达[1,2], 属于Ⅱ型跨膜蛋白质,
其C端暴露于质膜外, 可与B细胞表面的相应受体BCMA、
TACI (transmembrane activator and CAML-interactor)[3～6]、BAFF-R[8～10]结合。
大肠杆菌表达系统工艺简单、
表达量高、 成本低廉。 但也有难以识别某些真核密码子、 易于形成包含体且包含体往往难以复性等缺陷。
本实验在大肠杆菌中以包含体形式实现了C-BLyS的高表达。 经两次超声处理,
C-BLyS蛋白的纯度即可达到80%以上, 大大简化了C-BLyS的纯化工艺。 针对稀释复性带来的浓缩成本较高的缺陷, 我们建立了透析复性C-BLyS的方法。 经透析复性和纯化的C-BLyS可以特异性地与BCMA-Fc融合蛋白结合。 进一步的功能研究证实, C-BLyS能有效刺激体外培养的小鼠脾脏细胞增殖, 明显增强小鼠对外界免疫原的免疫应答水平, 可望开发成一种新型的免疫增强剂。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
人胎脑cDNA文库由中科院上海生物化学与细胞生物学研究所陈江野研究员惠赠。 表达质粒pT7450由本实验室构建并保存。 BCMA-Fc融合蛋白由本室制备。 内切酶与DNA聚合酶购自TaKaRa公司。 pGEM-T载体购于Promega 公司。 宿主菌E. coli BL21 CodonPlus (DE3)
RIL购于Statagene公司。 DEAE-Sepharose 为Pharmacia 公司产品。 还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽购于北京鼎国生物技术公司。 山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗人IgG-HRP购自华美生物工程有限公司。
弗氏完全佐剂、MTT、山羊抗小鼠IgM、溶菌酶购自Sigma公司。 RPMI 1640培养基购自Invitrogen公司。
缓冲液 S: 50 mmol/L Tris, 1 mmol/L
EDTA, pH 8.0
缓冲液 R: 40 mmol/L Mops, 30 mmol/L
NaCl, 1 mmol/L GSH, 1 mmol/L GSSG, pH 7.3
1.2 方法
1.2.1 C-BLyS
cDNA的克隆 根据BLyS cDNA序列, 设计以下2对引物。
BLyS-F1,
5′-TCACGCCTTACTTCTTGCC-3′
BLyS-R1,
5′-CATGGTGTAAGTAGGTCACAGC-3′
BLyS-F2,
5′-CATATGGCCGTTCAGGGTCCAGAA-3′
BLyS-R2,
5′-AAGCTTTCACAGCAGTTTCAATGCACCAA-3′
以BLyS-F1和BLyS-R1为引物、 人胎脑cDNA文库为模版,
进行第一轮PCR扩增。 以第一轮扩增产物为模版、 BLyS-F2 和BLyS-R2为引物,
进行第二轮扩增。 扩增得到的PCR产物经酶切鉴定后, 克隆至pGEM-T载体测序。
1.2.2 表达质粒pT7450-C-BLyS的构建 NdeI/HindIII酶切pGEM-C-BLyS和表达载体pT7450,
胶回收相应片段, 按常规方法[11]构建表达质粒pT7450-C-BLyS。
1.2.3 C-BLyS的表达 C-BLyS转化菌于37 ℃、250
r/min培养至A600到0.5～0.6。
加IPTG至终浓度为1 mmol/L, 30 ℃继续培养数小时后收获菌体。 期间每隔1
h取样一次。
1.2.4 C-BLyS包含体的纯化 菌体以缓冲液S悬浮, 冰浴中超声波破碎。
裂解液经8000 r/min离心10 min（JA-20转头）, 弃上清液,
沉淀重悬于缓冲液S中, 置冰浴中再次超声波破碎,
收集沉淀。
1.2.5 C-BLyS包含体的溶解与复性 纯化的包含体溶于8 mol/L脲（0.5%巯基乙醇)中,
4 ℃搅拌2 h充分溶解。 12 000 r/min离心20 min（JA-20转头）, 收集上清液。 将包含体溶液以8 mol/L脲（0.5％巯基乙醇）稀释至1.5 g/L, 依次对含4
mol/L、 2 mol/L、 1 mol/L、
0 mol/L脲的缓冲液 R透析。
1.2.6 C-BLyS的纯化 复性完成后, 将C-BLyS复性液加样于DEAE-Sepharose柱, 以30～800 mmol/L NaCl浓度梯度洗脱15个柱体积,
收集峰面积最大的蛋白质组分, 对PBS透析两次,
分装后-20 ℃冻存。
1.2.7 C-BLyS的功能研究 （1）C-BLyS与BCMA-Fc的相互作用TNF、溶菌酶、C-BLyS分别以PBS稀释至15 mg/L, 包被96孔板, 100 μL/孔。
4%脱脂奶粉封闭96孔板30 min。 20 mg/L BCMA-Fc加入各样品孔,
50 μL/孔, 37 ℃保温30
min, 洗去未结合的BCMA-Fc。
各孔加入羊抗人IgG-HRP（1∶1000） 50 μL/孔, 37 ℃保温30
min, 洗去未结合的二抗。 常规TMB显色, 测定孔A450。
(2)对小鼠脾细胞增殖的影响无菌分离小鼠脾细胞, 用RPMI
1640调节细胞密度至2×106/mL。 将脾细胞悬液加入96孔板,
每孔100 μL。 每孔内分别加入相应浓度的C-BLyS和山羊抗鼠IgM。
37 ℃、 5% CO2培养72 h后每孔加入10
μL 5 g/L MTT, 37 ℃、5% CO2培养5
h, 加入100 μL酸性SDS（15％
SDS, 15 mmol/L HCl）, 37 ℃过夜, 测定各孔的A570值。
(3)C-BLyS对小鼠体液免疫应答的影响等体积溶菌酶溶液与弗氏完全佐剂混合, 腹腔免疫10周龄雌性BALB/c小鼠20只, 100 μg/只。
免疫后的小鼠随机分成4组, 每组5只。
3组实验组每只分别尾静脉注射C-BLyS 0.2 μg/日、1
μg/日、5 μg/日。
对照组每日注射PBS, 共7天。 第8天采血,
间接ELISA检测血清抗溶菌酶IgG和IgM水平[12]。
1.2.8 统计数据 均采用SPSS做t检验, P<0.05有显著差异。
2 结果（Results）
2.1 C-BLyS的表达
加入IPTG诱导1 h后,
C-BLyS已有明显表达。 诱导4
h后C-BlyS占菌体总蛋白质的比例达到最高, 约为50%（图1）。
Fig.1 Relationship of C-BLyS
expression to induction time
M, protein marker; 0, before induction;
1, 1 h after induction; 2, 2 h after induction; 3, 3 h after induction; 4, 4 h
after induction; 5, 5 h after induction; 6, 6 h after induction.
2.2 C-BLyS的复性与纯化
经两次超声处理,
C-BLyS的纯度已达到80%以上。 复性后的C-BLyS, 在非还原胶上绝大多数保持单体形式, 少数为二聚体, 未见有多聚体形式,
单体所占的比例达90%以上。 复性后的C-BLyS, 经一次DEAE-Sepharose纯化, 纯度达90%左右（图2）。
Fig.2 Refolding and purification of
C-BLyS
M, protein marker; 1, 3, reduction PAGE
of C-BLyS; 2, 4, non reduction PAGE of C-BLyS; 5, C-BLyS, unpurified; 6,
C-BLyS, purified.
2.3 C-BLyS的功能研究
2.3.1 C-BLyS与BCMA-Fc的相互作用 由图3可以看出,
BCMA-Fc与96孔板上的TNF无相互作用,
而与BLyS存在明显的相互作用。
Fig.3 Specifically interaction of
C-BLyS and BCMA-Fc
1, the interaction of TNF and BCMA-Fc; 2,
the interaction of lysozyme and BCMA-Fc; 3, the interaction of C-BLyS and
BCMA-Fc.
2.3.2 C-BLyS对小鼠脾细胞增殖的影响 单独使用C-BLyS或抗-IgM抗体时, 对体外培养的小鼠脾脏细胞的促增殖作用不明显。
但当C-BLyS与共刺激因子抗-IgM抗体同时存在时,
脾脏细胞增殖效果明显增强, 且随着C-BLyS浓度的增加而显著增大（图4）
Fig.4 C-BLyS stimulates B cell
proliferation
1,
0 mg/L C-BLyS + 0 mg/L anti-IgM; 2, 0 mg/L C-BLyS + 20 mg/L anti-IgM; 3, 0.4
mg/L C-BLyS + 0 mg/L anti-IgM; 4, 2 mg/L C-BLyS + 0 mg/L anti-IgM; 5, 0.4 mg/L
C-BLyS + 20 mg/L anti-IgM; 6, 2 mg/L C-BLyS + 20 mg/L anti-IgM.
2.3.3 C-BLyS对小鼠体液免疫应答的影响 小鼠进行溶菌酶免疫后, 对实验组小鼠尾静脉给药,
分别注射C-BLyS 0.2 μg/日、1
μg/日、5 μg/日。
7天后, 实验组小鼠的血清中抗溶菌酶IgG比对照组有明显增加,
且增加幅度随C-BLyS给药剂量的增加而增加（表1, 图5）。
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Table 1 C-BLyS enhances IgG
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