(03340)Zhang XL et al.:Expression, Purification and Identification of Recombinant SARS Coronavirus Membrane Protein

Expression,
Purification and Identification of Recombinant SARS Coronavirus Membrane
Protein

ZHANG
Xiao-Li^#, WANG Jing-Ru^$#, ZHANG Yan^&, CHEN
Mao-Lin^&, ZHANG Wei, YANG
Sheng*, JIANG Wei-Hong*

( Institute of Plant Physiology and
Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the Chinese Academy of
Sciences, Shanghai 200032, China )

Abstract        A novel coronavirus (SARS-coronavirus,
SARS-CoV) was discovered as the pathogen of the severe acute respiratory
syndrome (SARS). According to studies with other coronaviruses, the membrane
protein (M protein) is the main structural protein and the recombinant M
protein may be useful as an antigen for detecting antibodies against
coronavirus and for preparing vaccine. In this work, the M protein of SARS-CoV
was expressed in E. coli as fusion protein with maltose binding protein at
N-terminus and MxeGyrA intein CBD at C-terminus. The recombinant protein was
identified by Western blot and mass spectrometry. The soluble parts of the cell
crude extract were then partially purified by MBP affinity chromatography. The
purified protein will be used for the studies on M protein’s structure and the
development of diagnostic method of SARS.

Key
words     severe acute respiratory
syndrome (SARS); coronavirus; recombinant M protein

__________________________________________

Received:
August 22, 2003    Accepted:
September 25, 2003

This
work was supported by the grants from the Anti-SARS Foundation of the Chinese
Academy of Sciences and SIPPE Foundation

^# Who contributed equally to
the work

^$
Shenyang
Pharmaceutical University

^&
Jilin
University

*
Corresponding authors: Tel, 86-21-64042090; Fax, 86-21-64042385; email, [email protected] & [email protected]

重组SARS冠状病毒M蛋白的表达、纯化及鉴定

张晓丽^#    王晶茹^$#   张燕^&  陈茂林^&    张伟    杨晟*  姜卫红*

( 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海
200032 )

摘要       SARS冠状病毒是人的严重急性呼吸综合征的病原体。 根据对其他种类冠状病毒的研究结果, 膜蛋白(M蛋白)是病毒主要的结构蛋白,
重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗。 SARS病毒M蛋白基因克隆到原核表达载体pMAL-cRI中, 利用N端和C端分别融合麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein和MxeGyrA intein CBD的策略, 在大肠杆菌中初步表达了重组M蛋白, 并通过Western印迹和质谱对蛋白质进行了鉴定。
重组蛋白质经亲和层析得到了部分纯化, 纯化后的蛋白质将用于功能研究与诊断试剂盒的研制。

关键词   严重急性呼吸综合征(SARS); 冠状病毒; 重组M蛋白

严重急性呼吸综合征(severe
acute respiratory syndrome, SARS)是新发现的传染病[1,2]。 SARS冠状病毒为导致该病的病原体[3,4], 其基因组测序已经完成[5,6]。

通过对已知冠状病毒的基因组比较, SARS病毒的膜蛋白(M蛋白)基因得到确认[7]。
M蛋白是冠状病毒基质糖蛋白, 由221个氨基酸构成。 分析显示M蛋白存在三个跨膜螺旋,
大致定位于15～37、
50～72和77～99氨基酸。 M蛋白在病毒颗粒内部有一个121个氨基酸的亲水区, 被认为是与核蛋白体相互作用的区域[7]。 对已知的冠状病毒的研究已经证明, M蛋白在冠状病毒的组装和出芽中起了关键的作用, M蛋白与S蛋白的结合对病毒包膜的构成是必不可少的[8]。 M蛋白还与病毒引起的细胞凋亡密切相关, 在没有其他病毒组分的情况下, 单独的M蛋白就可以引起HeLa细胞和BHK细胞的凋亡[9]。 M蛋白在病毒侵染的早期抑制宿主细胞的基因转录[10]。

重组M蛋白可被用来作为抗原检测对应冠状病毒的感染和制备疫苗[11,12]。
因此, 高效表达和纯化重组SARS病毒M蛋白是诊治SARS的一个重要基础,
同时也是研究SARS病毒蛋白质结构与功能的必需环节。

1    材料和方法(Materials)

1.1   材料

1.1.1       质粒、菌株与培养基    大肠杆菌表达质粒pMAL-cRI和pTXB1购自New
England Biolabs公司。 质粒pBluescript
SK(+), 大肠杆菌宿主细胞JM109(DE3)为本实验室保存。 带有SARS冠状病毒M基因的质粒pXM、pBM系由生化细胞所谢幼华博士提供。

LB培养基[10 g/L胰化蛋白胨(tryptone),
5 g/L酵母提取物(yeast extract), 10 g/L NaCl,
pH 7.0]用于培养E. coli; 丰富培养基(10 g/L胰化蛋白胨,
5 g/L酵母提取物, 5 g/L NaCl, 2 g/L葡萄糖)用于重组蛋白质的表达。

1.1.2       试剂       PCR引物由赛百盛合成。 限制性内切酶、 PyrobestTM DNA 聚合酶、 dNTP购自TaKaRa公司。 抗壳多糖结合域血清(anti-chitin binding domain
serum)和直链淀粉树脂(amylose resin)购自New England Biolabs公司。 二抗购自Promega公司。 其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.2   方法

1.2.1       表达载体的构建    (1)
表达载体pMALM的构建表达载体选用pMAL-cRI, 该载体为tac启动子, 重组表达的产物N端融合了麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)(约42 kD)。

用引物1和引物2以pXM为模板高保真扩增M基因,
回收PCR产物, 与EcoRV酶切后的pBluescript SK(+)连接, 得到pSKM,
再用BamHI和SalI酶切pSKM,
将得到的660 bp的片段与BamHI/SalI酶切后的pMAL-cRI连接, 得到pMALM。

引物1: 5′-GTGGATCC(BamHI)ATGGCAGACA-ACGGTACT-3′

引物2: 5′-GCTCTAGATTCTGTACTAGCAAAGC-3′

(2)
表达载体pTXBM的构建表达载体选用pTXB1, 该载体为T7启动子, 重组表达的产物C端融合了MxeGyrA intein CBD(约26 kD)。

用引物3和引物4以质粒pBM为模板PCR扩增M基因, NdeI和XhoI酶切PCR产物,
与NdeI/XhoI酶切后的pTXB1连接,
得到pTXBM。

引物3: 5′-GGAATTCCATATG(NdeI)GCAGACAA-CGGTACT-3′

引物4: 5′-AGACCTCGAG(XhoI)CTGTACTAGCAA-AGCAATA-3′

(3)
表达载体pMALMD的构建用引物5和引物6以pTXBM为模板,
PCR扩增得到C端融合了MxeGyrA intein CBD蛋白基因的M基因,
用XbaI和PstI分别酶切PCR产物和质粒pMAL-cRI, 连接,
得到pMALMD。

引物5: 5′-AAACTGCAG(PstI)TCATTGAAGCTGCCACAAGGCAG-3′

引物6: 5′-TGCTCTAGA(XbaI)ATGGCAGACAACGGTACTATTAC-3′

1.2.2       表达条件       当含表达载体的菌体的A600为0.6时, 用0.5
mmol/L IPTG 诱导, 37 ℃培养2小时。 离心收集菌体, 悬浮于适量的细胞破碎液(20
mmol/L Tris-HCl, 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT), 并用超声波破碎细胞, 得到的细胞粗提液用SDS-PAGE进行分析。

1.2.3       表达产物的纯化    在4 ℃条件下将上述细胞粗提液上样流经1 mL的直链淀粉树脂, 用10倍柱体积的20
mmol/L Tris-HCl (pH 7.4), 200 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L β–巯基乙醇缓冲液洗柱子,
然后在上述缓冲液中加入10 mmol/L麦芽糖洗脱目的蛋白质。

1.2.4       免疫印迹检测       根据Promega公司的《The
Source for Discovery》第三版中提供的方法操作。 采用的一抗为抗壳多糖结合域血清(New England Biolabs, Cat.# S6654S), 稀释度为1∶5000;
二抗为抗免 IgG (Fc) Ap 结合物(Promega, Cat.# S383B), 稀释度为1∶3000。
显色底物为BCIP/NBT (Promega, Cat.#
S3771)。

1.2.5       重组蛋白质的质谱鉴定       细胞粗提液用10% SDS-PAGE分离, 考马斯亮蓝染色交中科院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心进行质谱鉴定。 测定方法[13]:
割胶回收目的蛋白质, 用胰蛋白酶酶解蛋白质后进行测试。 质谱测试主要参数如下:
测试仪器型号为LCQ-DECA-XP, 检测方式为正离子, 进样方式为纳喷,
毛细管温度为200度, 反相C8柱8 mm×150
mm(RP-18), 扫描范围为400～2000 kD。

2    结果和讨论(Results
and Discussion)

2.1   M蛋白在表达过程中的溶菌现象

表达M蛋白有一定难度, 目前为止只有犬冠状病毒(Canine
coronavirus)中的M蛋白用pQE30得到了表达,
且表达量很低[11]。
为了表达M蛋白, 我们尝试了pQE30以及pET24a、
pET32b、 pGEX2T、 pGEX4T、
pKK233-2、 pT7ZZa、 pThioHisA、
pTYB12等许多原核表达载体和pPIC9、 pPIC3.5K、
pAS2等真核表达载体,但用SDS-PAGE都没能检测到M蛋白的表达。 最终采用pMAL-cRI构建表达质粒才获得了表达产物。

将含有M蛋白基因的质粒pMALM转入宿主细胞JM109(DE3)进行诱导表达。 有趣的是, 在加入IPTG诱导后细胞发生了裂解现象(A600降低到0.3以下),
而不加入IPTG时细胞生长正常, 这暗示溶菌现象可能与IPTG诱导的蛋白质表达相关。 将溶菌后的上清液取3
μL加入到另一个新鲜培养的大肠杆菌菌液中, 菌又能正常生长, 这说明溶菌的原因不是嗜菌体, 而可能是表达的M蛋白。 因为噬菌体能在菌中自我繁殖, 微量的噬菌体会在菌中大量繁殖, 使菌体裂解,
而M蛋白不能自我繁殖, 当其被转移到新的培养液中时量不会增加, 极微量的M蛋白不能引起菌体裂解。

M蛋白引起大肠杆菌细胞死亡的原因目前还不清楚, 也许它像其他冠状病毒中的M蛋白一样, 具有出芽功能,
在出芽的过程中引起大肠杆菌细胞膜的裂解, 从而引起细胞死亡; 或者它可以抑制大肠杆菌的基因转录, 使细胞发生凋亡。

2.2   M蛋白在载体pTXBM中的表达

由于质粒pMAL-cRI的多克隆位点前有一段42 kD的融合蛋白质,
因此含pMALM的表达细胞经诱导后产生的M蛋白N端带有融合蛋白质。 溶菌现象表明,此时M蛋白可能依然有出芽功能。
假设融合蛋白质在M蛋白的C端,
这样也许可以改变蛋白质的折叠情况, 使M蛋白不再具有出芽功能,
也就是菌体就不会被裂解, 使M蛋白有可能得到高表达。
因此构建了融合蛋白质在M蛋白C端的载体pTXBM。

然而, 实验表明pTXBM不能在大肠杆菌中得到高表达。
这说明M蛋白的成功表达不仅依赖于融合蛋白质, 还与所用的表达载体的特性有关。

2.3   pMALMD的表达、纯化以及免疫印迹检测

由于pMALM表达时有溶菌现象, 而pTXBM又不能在大肠杆菌中高表达, 因此构建了pMALMD,
希望通过在M蛋白的N端和C端都融合蛋白质, 抑制M蛋白的溶菌现象, 从而使M蛋白得到高表达。

含pMALMD的表达细胞经IPTG诱导后,
没有像pMALM那样出现溶菌现象, 而是在约93
kD处获得一新蛋白质(图1), 该蛋白质大小与估算的重组表达的M蛋白分子量相当。 这说明M蛋白应该已经得到了表达,也说明或许在N端和C端都融合了蛋白质后M蛋白的溶菌功能确实得到了抑制。

Fig.1       SDS-PAGE analysis of recombinant
M protein expressed in E. coli JM109 (DE3)

E. coli
JM109(DE3) was induced with 0.5 mmol/L IPTG for 2 h at 37 ℃,
cell sonicate was loaded onto a 10% SDS-PAGE. 1, JM109(DE3)/pMALMD, pellet; 2,
JM109(DE3)/pMALMD, supernatant; 3, marker(from up to down: 97 kD, 66 kD, 43 kD,
31 kD); 4, JM109(DE3)/pMALMD, whole cell; 5, JM109(DE3)/pMAL-cRI, whole cell
(control).

重组表达的蛋白质用抗融合蛋白质MxeGyrA intein CBD的抗体抗-CBD血清进行了Western印迹检测(图2)。 结果表明, 该93
kD的蛋白质能与抗-CBD血清结合, 说明该蛋白质应为融合了C端融合蛋白质MxeGyrA intein CBD的重组蛋白质。含pMALMD的表达细胞粗抽提液的可溶性部分经直链淀粉树脂可以得到初步纯化(图3)。
重组蛋白质纯化后伴随着一条约48 kD左右的条带, 这是大肠杆菌自身的MBP与直链淀粉树脂结合的副产物。

2.4   质谱鉴定结果

因为M蛋白的活性难以检测, 因此需用质谱对表达产物进行确证。
从质谱峰图中解析出的肽段序列见表1。
搜索数据库表明, EITVTSRE、CDIKDLPK以及VGTDSGFAAYNR三条肽段只在假定的蛋白M中存在,
因此鉴定为假定的蛋白M中的片段。 这说明重组融合蛋白质中确实含有M蛋白。

Table 1   Trypsin peptides of SARS virus M protein determined by
MS

_________________________________

感谢军事医学科学院为本研究提供BJ-01病毒株;感谢上海生命科学研究院抗击SARS办公室的大力协助; 感谢生化与细胞所谢幼华博士提供M基因;感谢生化与细胞所廖侃研究员、植物生理生态所陈晓亚研究员提供实验上的帮助; 感谢本实验室俞浩、朱颖、沈美娟的协助。

References

1     Poutanen SM, Low DE,
Henry B, Finkelstein S, Rose D, Green K, Tellier R et al. Identification of
severe acute respiratory syndrome in Canada. N Engl J Med, 2003, 348(20): 1995－2005

2     Lee N, Hui D, Wu A,
Chan P, Cameron P, Joynt GM, Ahuja A et al. A major outbreak of severe acute
respiratory syndrome in Hong Kong. N Engl J Med, 2003, 348(20): 1986－1994

3     Peiris JSM, Lai ST,
Poon LLM, Guan Y, Yam LYC, Lim W, Nicholls J et al. Coronavirus as a possible
cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003, 361(9366): 1319－1325

4     Ksiazek TG, Erdman D,
Goldsmith CS, Zaki SR, Peret T, Emery S, Tong S et al. A novel coronavirus
associated with severe acute respiratory syndrome. N Engl J Med, 2003, 348(20):
1953－1966

5     Rota PA, Oberste MS,
Monroe SS, Nix WA, Campagnoli R, Icenogle JP, Pe�aranda
S et al. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute
respiratory syndrome. Science, 2003, 300(5624): 1377－1378

6     Marra MA, Jones SJM,
Astell CR, Holt RA, Brooks-Wilson A, Butterfield YSN, Khattra J et al. The
genome sequence of the SARS-associated coronavirus. Science, 2003, 300(5624):
1399－1404

7     Qin ED, Zhu QY, Yu M,
Fan BC, Chang GH, Si BY, Yang BA et al. A complete sequence and comparative
analysis of strain (BJ01) of the SARS-associated virus. Chinese Sci Bull, 2003,
48(10): 941－948

8     de Haan CAM, Smeets M,
Vernooij F, Vennema H, Rottier PJM. Mapping of the coronavirus membrane protein
domains involved in interaction with the spike protein. J Virol, 1999, 73(9):
7441－7452

9     Kopecky SA, Willingham
MC, Lyles DS. Matrix protein and another viral component contribute to
induction of apoptosis in cells infected with vesicular stomatitis virus. J
Virol, 2001,75(24): 12169－12181

10    Kopecky SA, Lyles DS.
Constrasting effects of matrix protein on apoptosis in HeLa and BHK cells
infected with vesicular stomatitis virus are due to inhibition of host gene
expression. J Virol, 2003, 77(8): 4658－4669

11    Wang LF, Gould AR, Selleck
PW. Expression of equine morbillivirus (EMV) matrix and fusion proteins and
their evaluation as diagnostic reagents. Arch Virol, 1997, 142: 2269－2279

12    Elia G, Fiermonte G, Pratelli
A, Martella V, Camero M, Cirone F, Buonavoglia C. Recombinant M protein-based
ELISA test for detection of antibodies to canine coronavirus. J Virol Methods,
2003, 109(2): 139－142

13    Shao XX, Zeng R, Xia QC.
Peptide mapping and primary structural analysis of cytochrome C by liquid
chromatography-mass spectrometry. J Chinese Mass Spectrometry Society, 1998,
19(4): 1－7

Updated
at: 2003-12-16