Short Communication

Purification
of a Big Defensin from Ruditapes philippinesis and Its Antibacterial Activity

WEI Yu-Xi*, GUO Dao-Sen, LI Rong-Gui, CHEN
Hao-Wen¹, CHEN Pei-Xun

( Department of Biology, Qingdao
University, Qingdao 266071, China; 1 First Institute of Oceanography, State
Oceanic Administration, Qingdao 266061, China)

Abstract        A
novel big defensin was isolated and characterized from the plasma of Ruditapes
philippinesis. It was purified to homogeneity by means of precipitation with (NH4)2SO4,
gel-exclusion chromatography, two kinds of cation-exchange chromatography and
named RPD-1. Its relative molecular mass was 24.8 kD by means of SDS-PAGE. By
means of ABI437 amino acid sequence analyser, its 11 NH2-terminal amino acid
sequence is AVPDVAFNAYG. Two databank systems (NCBI and EBI/EMBL) was indexed,
no sequence with homology to RPD-1 was found. Furthermore, it exhibited strong
inhibition on the growth of Gram-negative and -positive bacteria. Minimal
inhibitory concentration (MIC) of RPD-1 against Staphylococcus aureus, Bacillus
subtilis, Micrococcus tetragenus, Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio anguillarum was 9.6 mg/L, 76.8 mg/L, 38.4 mg/L, 76.8 mg/L, 19.2 mg/L,
19.2 mg/L respectively.

Key
words     Ruditapes philippinesis
defensin; purification; amino acid sequence; antibacterial activity

_________________________________

Received:
August 19, 2003    Accepted:
September 29, 2003

This
work was supported by a grant from the National Natural Sciences Foundation of
China (No. 40086001)

*
Corresponding author: Tel, 86-532-5953227; Fax, 86-532-5953138; e-mail, [email protected]

菲律宾蛤仔(Ruditapes
philippinesis)血浆中防卫素的纯化及其抑菌功能

魏玉西*         郭道森     李荣贵     陈皓文¹         陈培勋

( 青岛大学生物系,
青岛 266071; 1 国家海洋局第一海洋研究所, 青岛
266061 )

摘要       经硫酸铵沉淀、凝胶排阻层析和离子交换层析, 自菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinnesis）血浆中分离纯化得到一种新的蛋白质――防卫素RPD-1（Ruditapes philippinesis defensin-1）。
经SDS-PAGE分析, 其估计分子量为24.8
kD; 经ABI473蛋白质自动测序仪测定, 其N端部分氨基酸序列为AVPDVAFNAYG。 在NCBI和EBI/EMBL两个蛋白质数据库中未发现任何与该蛋白质有同源性的已知蛋白质。 该蛋白质对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抗性。 对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、
枯草杆菌（Bacillus subtilis）、
四联微球菌（Micrococcus tetragenus）、
大肠杆菌（Escherichia coli）、
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和鳗弧菌（Vibrio anguillarum）的最小抑菌浓度分别为9.6 mg/L、
76.8 mg/L、 38.4 mg/L、 76.8 mg/L、
19.2 mg/L和19.2 mg/L。
实验结果证明RPD-1为一种新的防卫素蛋白质。

关键词   菲律宾蛤仔防卫素; 血浆; 纯化;
抑菌功能

尽管海洋贝类软体动物本身缺乏免疫球蛋白, 但由于其长期生活于富含海洋微生物的环境中, 逐渐形成了抵抗外来微生物侵袭的有效体系。 其防御机制主要依赖于血细胞和体液的抗菌活性[1,2]。 从海洋软体动物中已发现腹足类抗细菌或抗微生物的蛋白质, 分子量在56～250
kD之间[3]。
从近海蟹分离出的抗菌蛋白估计分子量在70 kD以上[4]。 而关于海洋双壳贝类体液中抗微生物病原组分的分子结构所知相对甚少。 目前,
国外学者从虾、 贻贝等无脊椎动物中发现的抗菌物质均属于防卫素家族的低分子量蛋白质[5～8],
国内尚未见关于海洋动物防卫素的研究报道。 所有已发现的防卫素均表现出抗菌活性, 但不同来源的防卫素在结构方面却有很大不同, 作用方式也具多样性。 防卫素在医药、农业等方面的应用具有诱人前景[9]。

本实验利用蛋白质分离、纯化技术, 以金黄色葡萄球菌为指示菌, 从菲律宾蛤仔血浆中纯化到一种新的防卫素RPD-1（Ruditapes philippinesis defensin-1）。

1    材料和方法(Materials
and Methods)

1.1   菲律宾蛤仔与菌株

菲律宾蛤仔（Ruditapes
philippinnesis）采自青岛胶南海域。 革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、
枯草杆菌（Bacillus subtilis）、
四联微球菌（Micrococcus tetragenus）和革兰氏阴性细菌包括大肠杆菌（Escherichia coli）、
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由中国海洋大学提供。 革兰氏阴性细菌鳗弧菌（Vibrio anguillarum）由中国科学院海洋研究所提供。

1.2   主要仪器及试剂

仪器:超滤离心管（Pall-Gelman, 美国）, Bio-Gel（Bio-Rad,
美国）, CM-Cellulose（进口分装）, HiTrapTM SP HP 预装柱（Amersham, 瑞典）,
冷冻离心机（上海）, ABI437蛋白质自动测序仪(美国ABI公司), 核酸蛋白质检测仪(上海嘉鹏科技有限公司)。

试剂:牛胰蛋白酶抑制剂（Amersham, 瑞典）,
超低分子量蛋白质标识物（Sigma, 美国）, Tricine（Sigma,
美国）。 其他试剂均为国产市售（分析纯）。

1.3   RPD-1的分离纯化

1.3.1       硫酸铵分级沉淀    自新鲜菲律宾蛤仔抽取血淋巴, 加海洋抗凝剂及牛胰蛋白酶抑制剂, 于冷冻离心机（10 000 r/min, 4 ℃）中离心1 h去除血细胞得血浆。
血浆在慢搅下加入固体硫酸铵使之达25%饱和度（4 ℃）,
离心收集上清液（10 000 r/min, 4 ℃）。 重复上述操作使硫酸铵饱和度分别达35%、 45%、
55%、 65%和75%饱和度,
分别收集上清液和沉淀, 沉淀以20 mmol/L HCl溶解并检测抗菌活性, 方法见1.4.3,
以确定最佳硫酸铵饱和度。

1.3.2       凝胶排阻层析       使用Bio-Gel P-10凝胶柱, 以20
mmol/L HCI平衡后上样, 接着以同样溶液洗脱, 分部收集,
核酸蛋白质检测仪检测A280, 并检测各峰活性, 方法见1.4.3.

1.3.3       离子交换层析Ⅰ    使用CM-Cellulose离子交换柱, 预先以10
mmol/L NaAc (pH 3.5) 平衡, 以0～1.5
mol/L NaCl / 10 mmol/L NaAc (pH 3.5)梯度洗脱,
分部收集, 核酸蛋白质检测仪检测A280。 经截留值为1 kD的超滤离心管脱盐、浓缩,
并检测各峰活性, 方法见1.4.3.

1.3.4       离子交换层析Ⅱ    使用HiTrap SP HP 预装柱, 预先以50
mmol/L NaAc (pH 3.5)平衡, 以0～1.0
mol/L NaCl / 50 mmol/L NaAc (pH 3.5) 进行梯度洗脱,
分部收集, 核酸蛋白抟检测仪检测A280, 使用分子量截留值1
kD的超滤离心管脱盐, 检测各峰活性, 方法见1.4.3.

1.4RPD-1的部分性质鉴定

1.4.1       分子量测定    采用三层凝胶的不连续体系进行, 参照文献[10]并加以适当改进。 分离胶: 120 g/L T, 45 g/kg C (其中T代表1
L凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总克数, C代表凝胶溶液中总量为1 kg的单体和交联剂中含交联剂的克数。
下同); 间隙胶: 80 g/L T, 24 g/kg C; 浓缩胶: 60 g/L T, 30 g/kg C。
染色与脱色方法: 电泳完毕的凝胶先在蒸馏水中洗5～10
min, 在新配制的50 g/L戊二醛中固定1 h。 以0.25 g/L考马斯亮蓝G加100 g/L醋酸染色1
h, 然后以100 g/L醋酸脱色10 h。 超低分子量标识物组成为: 兔肌磷酸丙糖异构酶（26.6
kD）、 马心肌红蛋白（17.0
kD）、 牛奶α–乳清蛋白（14.2 kD）、 抑蛋白酶肽（6.5 kD）、 氧化型牛胰岛素B链（3.5
kD）、 缓激肽（1.1
kD）。

1.4.2       氨基酸序列测定    使用ABI 473蛋白质自动测序仪进行。

1.4.3       生物活性检测       以金黄色葡萄球菌为指示菌, 采用平板生长抑制法[3,11],
对抗菌活性物质进行追踪检测。 最小抑菌浓度(MIC)的测定采用二倍稀释法进行[12]。

2    结果和讨论
(Results and Discussion)

2.1   RPD-1的分离纯化

2.1.1       硫酸铵分级沉淀    以不同饱和度的硫酸铵处理菲律宾蛤仔血淋巴, 所得蛋白质沉淀及上清液对金黄色葡萄球菌的抑制结果见表1。
由表可见, 25%饱和度的硫酸铵所得沉淀活性低, 而上清液抑菌活性较强;
在25% ～ 55%饱和度之间,
随着硫酸铵饱和度的逐渐提高, 蛋白质沉淀物抑菌活性逐渐增强, 并在55%饱和度下所得蛋白质沉淀活性达最强。 因此,
最适硫酸铵饱和度即为55%。
在该范围内获得的蛋白质沉淀应包括绝大多数抑菌活性蛋白质, 且由于选择的饱和度范围较窄, 在有效沉淀浓缩活性蛋白质的同时, 可大大减少其他非活性蛋白质, 有利于提高后续分子筛层析的分离效率。

Table 1   Antibacterial activity of the plasma from Ruditapes philippinnesis
by treatment with (NH4)₂SO4

–, no inhibiting effect; +, little
inhibiting effect; ++, some inhibiting effect; +++, remarkable inhibiting
effect.

2.1.2       凝胶排阻层析       将55%硫酸铵饱和度所得蛋白质沉淀溶解, 上Bio-gel P-10凝胶柱, 洗脱曲线见图1。 该步层析有两个大峰,
第二峰具较强抑菌活性。 将第二峰洗脱液合并,
以超滤离心管进行浓缩。

Fig.1       Chromatography of the active
fraction from Bio-Gel P-10

2.1.3       离子交换层析I     将2.1.2中所得浓缩液上样于CM-Cellulose
离子交换柱, 洗脱曲线见图2。
该步层析得到3个峰, 分别进行抑菌活性测定,
结果显示第2、第3峰显示较强抑菌活性,
SDS-PAGE检验结果表明这两个峰虽均为不纯组分, 但主要蛋白质带一致。 因此,
将二峰合并, 以超滤离心管脱盐、 浓缩。

Fig.2       Chromatography of the active
fraction from CM-Cellulose

2.1.4       离子交换层析II    将2.1.3中所得浓缩液上样于HiTrap
SP HP 阳离子交换预装柱, 洗脱曲线见图3。
该步层析得到两个洗脱峰, 经活性测定, 结果为第1峰无抑制金黄色葡萄球菌活性, 第2峰有较强抑菌活性。

Fig.3       Chromatography of active
fraction from HiTrap SP HP

2.2   RPD-1的部分性质

2.2.1       纯度及分子量测定       还原和非还原条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果证明, 离子交换层析Ⅱ所得洗脱峰中第2峰显示一条谱带, 为单一组分（RPD-1）,
且相对分子量为24.8 kD (图4)。

Fig.4       Spectra of RPD-1 by SDS-PAGE

1, protein marker; 2, sample from the
second peak of Fig.3. Arrow means RPD-1.

2.2.2       RPD-1 N末端氨基酸残基序列分析    对RPD-1进行N末端氨基酸残基序列分析, 共分析了11个氨基酸残基, 结果为AVPDVAFNAYG。
将该序列与美国国家生物技术信息中心数据库（NCBI）、欧洲分子生物学实验室数据库（EBI/EMBL）中已知的蛋白质序列进行比较, 结果显示不存在同源性序列,
证明RPD-1是一种新的蛋白质。

2.2.3       RPD-1 抗菌谱测定      RPD-1对6种细菌的活性谱见表2。 可见,
RPD-1对6种受试菌均有较强的抑制作用。 其中,
RPD-1对金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌和四联微球菌3种革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为9.6
mg/L、 76.8 mg/L、 38.4 mg/L; RPD-1对大肠杆菌、 副溶血弧菌和鳗弧菌3种革兰氏阴性菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为76.8
mg/L、 19.2 mg/L、 19.2 mg/L。

Table 2   Antibacterial activity of RPD-1

综上所述,
本文从菲律宾蛤仔血浆中分离出一种新的防卫素, 并选用了6种细菌对其进行抗菌谱研究。
然而, 目前已知的海洋无脊椎动物防卫素大多是从相应的动物血细胞纯化出来的, 且具广谱抑菌活性。 因此, 对菲律宾蛤仔血细胞中防卫素的研究有待进一步展开, 以全面了解其在自然条件下的防御机制。 同时,
防卫素的广谱杀菌活性展现了一条开发新型的、理想的抗生素途径。 尤其如今科学发展到了后抗生素时代, 由于很多抗生素具有毒副作用、 微生物也对很多抗生素产生了抗药性, 这加速了人们对防卫素的研究和开发。

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Updated
at: 2003-12-16