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Short |
Prokaryotic
Expression and Characterization of Rice Rac Protein osRACB
LUO
Min#, TANG Chao-Rong#, WU Nai-Hu*
( Institute of Genetics and Developmental
Biology, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China )
Abstract As
the sole ubiquitous signal GTP-binding protein family in higher plants, Rac
genes act as pivotal molecular switches and participate in many regulations of life
activities. In order to study the biochemical characteristics of rice Rac
protein osRACB, the complete coding sequence of osRACB was cloned into
expression vector pET28a and expressed in E. coli BL21(DE3). After
induced by 1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 4 h, the fusion protein
His-osRACB was produced in a large amount. The fusion protein was purified by
Ni2+-NTA column and digested by thrombin. After a series of
processes including separation and recovery by electrophoresis, renaturation by
glutathione and concentration by ultrafiltration, pure osRACB protein in an
active form was obtained. The GTP-binding and hydrolyzing assay showed that
osRACB has strong GTP special binding and hydrolysis activity regulated by Mg2+.
By comparing it with another rice Rac protein osRACD, it can be concluded that
osRACB has stronger GTP-binding activity and weaker hydrolysis activity than
osRACD.
Key
words osRACB; prokaryotic
expression; special GTP-binding assay; GTPase hydrolysis activity; rice
________________________________________
Received:
September 4, 2003 Accepted:
October 23, 2003
This
work was supported by the grants from the National Plant Transgenic Research
and Industrialization Special Foundation of China (No. J00-A-005) and the Major
State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No.
2001CB1088)
# Who contributed equally to
this work
*
Corresponding author: Tel, 86-10-82610114; Fax, 86-10-62551591; e-mail, [email protected]
水稻osRACB基因的原核表达及其蛋白质产物的生化特性鉴定
罗 敏# 唐朝荣# 吴乃虎*
( 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100080 )
摘要 Rac蛋白作为高等植物中已知的惟一一类分布广泛的信号GTP结合蛋白, 在植物体众多生命活动调节中起着分子开关的作用。
实验将水稻Rac家族新成员osRACB基因克隆于原核表达载体pET-28a中, 转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌,
经IPTG诱导实现了目标融合蛋白质的高效表达。 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白质,
经凝血酶作用后得到osRACB非融合蛋白质。 该蛋白质经谷胱甘肽氧化还原体系复性和超滤浓缩后, 用于体外功能鉴定。 结果显示, osRACB蛋白具有与GTP特异性结合的活性以及水解GTP的功能。 与另一Rac蛋白osRACD相比较,
osRACB具有更强的GTP结合活性和较弱的GTP水解活性。
关键词 osRACB蛋白; 原核表达; GTP特异结合活性;
GTP水解活性; 水稻
G蛋白根据作用方式的不同以及分子量大小的差别, 分为异源三聚体和低分子量G蛋白两大类。 后者因氨基酸相似性的差异和功能的不同, 又可细分为Ras、
Rab、 Rac/Rho、 Arf/Sar和Ran五个亚类。 目前研究结果显示, G蛋白超家族中只有异源三聚体G蛋白、
Rac/Rho蛋白和Ras蛋白是真正的信号蛋白质[1], 其余亚类的G蛋白则主要参与囊泡或核运输的调节[2]。
同时, 三种信号G蛋白在信号途径中所起的作用也存在较大差异, 在动物信号系统中异源三聚体G蛋白和Ras蛋白起着主要作用。 而在植物体内, 异源三聚体G蛋白种类极少,
Ras蛋白也只在低等植物中发现少数几种; 相比之下植物中Rac基因分布广泛,
并且种类繁多。 针对三种信号G蛋白在动植物中分布的悬殊差别, 人们推测植物体的信号转导途径可能与动物有较大的不同, 并且Rac家族成员有可能在其中起着极其重要的作用[3,4]。
因此, 研究植物Rac基因及其编码产物的功能具有相当重要的生物学意义。
本实验室从水稻农垦58N
cDNA文库中筛选得到两个Rac家族新成员osRACB和osRACD,
其基因编码产物均为197个氨基酸[5,6]。 其中osRACB基因的表达与已知的水稻Rac基因有较大差别, 该基因的表达高度集中于茎部[5～8]。
为进一步在蛋白质水平上分析osRACB基因, 本研究构建了该基因的原核表达载体, 实现了BL21（DE3）宿主菌中目的蛋白质的高效表达, 并通过凝血酶作用获得osRACB非融合蛋白, 在此基础上对osRACB蛋白的生化特性进行鉴定。 同时我们还比较了osRACB与osRACD的蛋白质活性差异。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌JM109系本实验保存;
大肠杆菌BL21（DE3）菌株由北京大学生命科学院胡美浩教授实验室转赠, pET-28a质粒购自Novagen公司。
1.1.2 试剂 限制性核酸内切酶购自MBI公司;
T4 DNA连接酶、 DNA聚合酶购自Promega公司;
Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司; 蛋白质分子量标志购自Bio-Rad公司; 硝酸纤维素膜购自Millipore公司; [α-32P]GTP购自北京亚辉公司。
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建 根据osRACB起始密码子和终止子邻近序列设计引物[５], 并引入NdeI、
BamHI酶切识别位点序列, 同时将osRACB原来的弱终止密码子TGA改造成强终止密码子TAA。 其中5′端引物为5′-GCGCAT1.2.2蛋白质的诱导表达挑取携带目标质粒的单菌落接种于含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中,
37 ℃振荡培养8 h, 按1%（V/V）比例转接于新鲜培养基, 37 ℃振荡培养至A600为0.6时,
加入IPTG至终浓度1 mmol/L, 37 ℃诱导振荡培养4 h, 离心收集菌体,
经煮沸裂解, 进行SDS-PAGE电泳检测。
1.2.3 融合蛋白质的纯化 离心收集诱导培养4 h的大肠杆菌菌体,
置－70 ℃迅速冻存。 采用Qiagen公司Ni2+-NTA蛋白质纯化柱纯化目标融合蛋白质, 具体操作参照其说明书进行。
1.2.4 融合蛋白质的复性 采用改造后的谷胱甘肽复性缓冲体系进行蛋白质复性[9], 程序如下。 首先, 利用复性液I（2
mol/L 尿素、 100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA, pH 7.5）将蛋白质于4 ℃透析4
h; 随后, 转入复性液II（0.5
mol/L 尿素、 1 mmol/L GSSG、 2 mmol/L GSH、
100 mmol/L Tris-HCl、
5 mmol/L EDTA, pH 7.5）4 ℃透析4 h; 然后,
于复性液III（1 mmol/L GSSG、 2 mmol/L GSH、 100 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA、 5 mmol/L 精氨酸,
pH 7.5）中4 ℃透析8 h, 中间更换一次复性液III;
最后, 用复性液IV（100
mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L EDTA、 5 mmol/L精氨酸,
pH 7.5）4 ℃透析8 h, 中间更换复性液IV一次。 收集复性后蛋白质, 利用Millipore公司的Microcon
YM-10超滤柱进行超滤浓缩, Bradfard法测定蛋白质浓度后, 分装成5
μg的小包装－80 ℃冻存。
1.2.5 融合蛋白质酶切 向10 μg融合蛋白质的浓缩液中加入凝血酶裂解液（50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5、 150 mmol/L NaCl、 2.5 mmol/L CaCl2、 0.5 u凝血酶）[10],
25 ℃下反应3 h后, 通过SDS-PAGE电泳检测切割效率。
1.2.6 GTP结合试验 将1 μg纯化的osRACB、
osRACD蛋白经非变性PAGE电泳分离, 利用Bio-Rad的Trans-blot SD半干转膜仪按常规蛋白质电转膜方法转移至硝酸纤维素膜上（转移参数为20 V、 4 ℃
30 min）。 膜晾干后,
首先用预杂交液（50 mmol/L Tris-HCl、 5 mmol/L MgCl2、 0.3% Tween-20、 0.5 mmol/L EDTA、 5 mmol/L DTT、 0.3% BSA, pH 7.5） 30 ℃预杂交30
min; 然后更换预杂交液, 加入5 μL
[α–32P]GTP（3000 Ci/mmol)（约含10－9
mol/L GTP）, 30 ℃杂交15 min; 最后以不含BSA的预杂交液30 ℃洗膜三次,
每次5～10 min, 适当晾干后放射自显影[11,12]。
同时在不含Mg2+的结合体系中, 进行osRACB蛋白的GTP结合活性测试。
1.2.7 GTP竞争结合试验 分别取1 μg
osRACB活性蛋白质经非变性PAGE电泳分离转膜后,进行GTP、ATP竞争结合试验,
实验操作同上。 其中[α–32P]GTP终浓度均为10－９
mol/L, GTP竞争试验中分别再加入终浓度为10－8、
10－7、 10－6
mol/L的非同位素标记GTP, 即10、
102、 103倍的竞争GTP; ATP竞争试验则分别再加入终浓度为10－7、 10－６、
10－5、 10－4
mol/L的非同位素标记ATP, 即102、
103、 104、 105倍的竞争ATP。
1.2.8 GTP水解试验 根据无机磷可以与钼酸胺反应形成钼蓝的特性, 测定660 nm时下钼蓝的光吸收值A,
推算GTP水解后无机磷的释放量, 从而观察osRACB蛋白的GTP水解活性。 将1 μg
osRACB活性蛋白与不同量的GTP底物在反应缓冲液（0.05 mol/L Tris-HCl、pH 8.0, 0.1 mol/L MgCl2）中混合, 30 ℃下反应30
min, 加入TCA终止反应, 测定A660的钼蓝吸收峰曲线[9,13,14]。
2 结果(Results)
2.1 osRACB基因表达载体的分子鉴定
利用NdeI和BamHI酶切识别位点,
将PCR产物定向插入表达载体pET-28a, 构建表达质粒pET-osRACB。
提取重组质粒DNA, 通过酶切、 PCR以及核苷酸测序等手段进行阳性鉴定。
结果显示, 该表达质粒包含一约600 bp的NdeI-BamHI插入片段, 此片段包含osRACB基因完整的编码序列, 并且序列和可读框均完全正确, 表明已得到预期的原核表达载体, 进一步转化该表达质粒于大肠杆菌BL21(DE3)中,
以用于后期蛋白质诱导表达。
2.2 osRACB蛋白的诱导表达、纯化及复性
分别接种携带pET-osRACB重组质粒的菌株BL21(DE3)以及只含pET-28a的对照菌株BL21(DE3), 相同条件下经IPTG诱导培养4 h, 离心收集菌体。 电泳检测结果显示携带重组质粒pET-osRACB的菌株在分子量为24
kD的位置上产生有一条特异蛋白质条带, 其表达量约占细菌总蛋白质量的40%以上,
而对照菌株中均无此相应蛋白质条带产生(图1)。 溶菌酶裂解试验显示[15], osRACB融合蛋白基本以包含体形式存在于细胞质中。 利用8
mol/L尿素裂解菌体, 溶解包涵体后通过Ni2+-NTA层析柱进行蛋白质分离纯化。
融合蛋白质通过其N端His6标志与Ni2+离子之间的螯合作用, 特异性吸附于层析柱上,
经pH梯度洗脱后, 便可得到纯度高于90%的高纯His-osRACB融合蛋白（图1）。
Fig.1 15% SDS-PAGE analysis of the
expression of His-osRACB fusion protein after induced
M,
protein marker; 1, BL21(pET-28a) before induction; 2, BL21(pET-28a) induced for
4 h; 3, BL21(pET-osRACB) before induction; 4, BL21(pET-osRACB) induced for 4 h;
5, purified His-osRACB.
取部分纯化样品经凝血酶酶切后通过非变性凝胶电泳回收, 得到分子量约为21
kD的osRACB蛋白（图2）,
其大小与预期osRACB基因编码蛋白质大小相当。 osRACB蛋白复性过程中, 我们发现在常规G蛋白复性所用的谷胱甘肽氧化还原体系中[9], osRACB蛋白极易聚集形成沉淀, 从而大大降低天然活性蛋白质的得率。
在采取尿素浓度梯度降低和低尿素环境添加谷胱甘肽的措施后, 沉淀现象明显减弱, 同时复性前将osRACB蛋白浓度稀释至0.1 g/L, 并加入精氨酸辅助蛋白质稳定, 即可获得理想的蛋白质复性效果。
Fig.2 15% SDS-PAGE analysis of
His-osRACB and osRACB
M,
protein marker; 1, His-osRACB (24 kD); 2, osRACB (21 kD).
2.3 osRACB蛋白的GTP特异结合活性测定
纯化的1
μg osRACB、osRACD蛋白经非变性PAGE电泳分离转膜后, 进行GTP结合活性检测。 已知G蛋白的结合活性受效应物Mg2+的影响, 它通常与GTP・Mg2+形式的GTP进行结合,
在缺少二价阳离子的条件下, GTP与G蛋白的结合物将迅速发生解离。
因此, 本结合试验中Mg2+浓度控制在5 mmol/L, 从而保证osRACB和osRACD有较高的GTP结合活性以及其结合物的稳定性。 结果显示两蛋白质均有强杂交信号带(图3), 但osRACB蛋白的杂交信号明显强于osRACD蛋白,
说明osRACB、osRACD均具有GTP结合活性, 其中osRACB蛋白的结合活性更强。
Fig.3 GTP-binding assay of osRACB and
osRACD
1,
osRACB; 2, osRACD; 3, GTP-binding activity of osRACB without Mg2+.
分别用非同位素标记的GTP、ATP与同位素标记的GTP的竞争结合实验, 进一步证实了osRACB蛋白具有与GTP特异结合的活性。 图4显示,
加入100倍竞争性GTP时,
可将大部分与osRACB结合的[α–32P]GTP竞争掉; 而在加入105倍的竞争性ATP的试验中杂交信号仍基本无变化。
上述试验表明, osRACB具有强GTP特异结合活性。 同时, Mg2+缺失情况下的蛋白质GTP结合试验显示,
osRACB在缺少二价阳离子的条件下, 结合GTP能力大大降低（图3）。
Fig.4 GTP-binding competition tests of
osRACB
1, [α–32P]GTP+105-fold
ATP; 2, [α–32P]GTP+104-fold
ATP; 3, [α–32P]GTP+103-fold
ATP; 4, [α–32P]GTP+102-fold
ATP; 5, normal GTP-binding activity; 6, [α–32P]GTP+10-fold
GTP; 7, [α–32P]GTP+102-fold
GTP; 8, [α–32P]GTP+103-fold
GTP.
2.4 osRACB蛋白的GTP水解酶活性
已知G蛋白与GTP结合后,
在无GAP（GTP酶激活蛋白）的调控下,
仍将表现一定的自身GTP水解活性。 而GTP水解后释放的无机磷可与钼酸胺反应形成钼蓝, 在A660下有特异吸收峰,
从而可建立定磷实验, 测定蛋白质的体外GTP水解酶活性。 但由于GTP水解后形成的G蛋白与GDP的复合物会发生部分再解离生成GDP, 同时GTP也可自身水解生成无机磷, 从而干扰试验通过无机磷推断GTP水解量。 前人研究结果表明,
高浓度的Mg2+可稳定G蛋白与GDP的结合[１６],
因此本实验中将Mg2+的浓度控制在100 mmol/L, 同时平行测定GTP的自身水解量用于扣除此项干扰因素, 从而准确地检测osRACB水解GTP的酶动力学。 本实验分别将1 μg纯化的osRACB、
osRACD与不同量的GTP底物30 ℃下反应30
min, 加入TCA终止反应, 测定A660下的钼蓝吸收峰曲线。 研究结果显示,
在一定底物GTP浓度下, 随着底物量的增加,
osRACB水解产生的无机磷量呈现明显上升的趋势(图5); 当GTP浓度大于4 μmol/L后, 无机磷量保持一定,
甚至出现下降。 而osRACD水解产生的无机磷量不仅明显多于osRACB, 而且水解上升趋势较osRACB明显。 两种吸收峰曲线的变化特征, 显示两种蛋白质均具备一定的水解GTP的能力,
但osRACB水解活性弱于osRACD[9]。
Fig.5 GTPase hydrolysis activity of
osRACB and osRACD
3 讨论（Discussion）
作为高等植物中惟一一类已知的广泛分布的信号G蛋白,
Rac蛋白现已被证明参与细胞形态建成和生长、活性氧产生、激素反应以及控制细胞增殖、凋亡等生理功能调节的信号转导通路, 并且起着“分子开关”的关键性作用, 因此研究Rac蛋白对深入了解植物的信号转导通路网络具有重要意义[17～22]。
水稻中现已发现7种Rac基因,
其中3种是由日本Shimamoto 实验室[7,8]分离的, 分别被命名为osRac1、 osRac2、
osRac3; 美国Vejlupkova实验室分离了两个推测为Rac基因的cDNA片段, 分别命名为osRop4、 osRop5, 其功能至今未知;
同时本实验室分离得到两个基因, 分别命名为osRACB和osRACD[5,6]。
根据基因结构及其细胞定位和功能的不同[5], 这七种基因分属于Rac家族的两个小亚类,
其中osRACB、 osRACD、osRop5属于Ⅰ亚类, osRac1、osRac2、 osRac3、
osRop4为Ⅱ亚类。 在基因功能上,
osRACB、osRACD虽同属一个亚类, 但两者功能之间存在较大差异, 它们分属两条信号通路上的不同调控成员。 其中,
osRACD已被证明与水稻花粉管延伸相关[6,23], 而osRACB则可能主要参与调控茎部细胞生长分化的调节（本实验室待发表资料）。 水稻作为我国重要粮食作物,
同时对水稻中两个结构极其相似、生物学功能相差悬殊的Rac基因进行深入研究, 将有助于阐明水稻Rac蛋白信号转导通路网络与它们所调控的生物学功能之间内在的联系, 为开展水稻生物学的基础理论研究与生产应用研究奠定分子生物学的基础。
由于信号G蛋白在水稻中含量极低, 直接从植物体内分离纯化此类蛋白质程序相当复杂[24], 材料需求量大,
为在蛋白质水平研究osRACB的功能, 我们采取了体外表达及活性检测的研究手段。
体外活性实验表明, osRACB蛋白具有特异GTP结合活性和水解GTP的功能, 并且与osRACD相比, osRACB具有更强的GTP结合活性和较弱的GTP水解活性。 以氨基酸同源性65%的人Rac1为模板, 利用InsightⅡ软件对osRACB、osRACD进行三维结构预测[5], 比较结果显示两种蛋白质的Mg2+、GTP结合域以及GTP酶活性结构域的氨基酸完全相同, 三维结构基本重叠;
它们的差异主要集中在富含正电荷的游离羧基尾部, 此差异可能影响两种蛋白质的生物学定位和功能。 但体外活性分析试验显示,
两种蛋白质的GTP结合以及水解活性仍存在一定的差别。 已知Rac蛋白的分子调控机制与异源三聚体G蛋白不同,
其上游通过调控因子GEF（鸟嘌呤核苷酸交换因子）作用, 使得结合GDP的无活性Rac蛋白转变成结合GTP的活性蛋白质; 而下游则可通过GAP（GTP酶激活蛋白）和GDI（鸟嘌呤核苷酸解离抑制子）来调控其GTP水解活性。 因此, 我们推测功能结构域基本相同的osRACB、osRACD两种蛋白质体外活性间存在的差异, 可能是由于两者所依赖体内上下游调控因子程度的不同而引起。
由于人们于1993年才首次发现植物Rac蛋白[25],
其整体研究水平相对滞后。 目前有关植物Rac蛋白的信号作用机制多是基于动物、微生物Rac的研究成果进行的推测。 但众多研究显示动植物Rac信号系统存在一定的差异。 因此,
深入了解植物Rac蛋白作用机制, 对研究植物信号网络是十分必要的, 而osRACB作为首次发现的在水稻茎部高度表达的Rac基因, 对其蛋白质功能开展研究则更具重要意义。
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