Establishment
of a SCID Mouse Model for Synergistic Anti-tumor Effect of Human IL-12 and B7-1

GAO Jun*, ZHAO Ping¹, CHEN
Xiou-Hua², LI Mao, LONG Jian-Qiou, GU Ai-Mei, WU Xiao-Lan, CAO
Guang-Wen¹, QI Zhong-Tian¹

( Division
of Epidemiology, Institute of Naval Medicine, Shanghai 200433, China; ¹Second
Military Medical University, Shanghai 200433, China; ²Department
of Pharmacology, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industrial, Shanghai
200040, China )

Abstract        Human
IL-12(hIL-12) has weak effect on mouse immunity cells, so the practical animal
model is not available for the study of hIL-12 anti-tumor activity. In this
work, the improved Winn assay was applied to evaluate the synergistic
anti-tumor effects of hIL-12 and human costimulatory molecule B7-1(hB7-1) on
human tumor in HuPBL-SCID mouse model. Three gene transferring solutions―hIL-12, hB7-1 and their
mixture(1:1) ―were prepared
using the nonliposome transgene reagent and the expressing vectors, and hIL-12,
hB7-1 or their mixture were transferred into tumor cell A375 respectively. Then
A375 were co-injected into SCID mice with HuPBL, and rhIL-2 were injected i.p.
as an anti-tumor agitator. On the other hand, LoVo and SPC tumor cells were
also used to test the inhibitory effect of the mixture of hIL-12 and hB7-1. The
anti-tumor effect of transferred genes was estimated by detecting tumor
inhibition rate. Furthermore, the histochemical change of A375 implanting tumor
tissue was also observed. Results showed that, to A375, the tumor inhibition
rate of hIL-12, hB7-1, or their mixture were 74.06%, 66.98%, and 93.40%,
respectively (P<0.01); and the mixture showed a good synergistic effect according to the Webb's fraction multiplication law. The tumor inhibition rate of the mixture in LoVo and SPC implanted mice were 98.37% and 97.39% respectively, also showing a good synergistic effect. Histochemical study in A375 implanted mice showed that in gene transfected mice, tumor cells were greatly inhibited and fully intruded by HuPBL cells; while in control group, tumor cells grew very well and HuPBL showed a conglomeration. At last, the human IgG and T cells in PBL of HuPBL-SCID mice were higher than non-HuPBL-SCID mice implanted A375; which showed that HuPBL-SCID mice could be applied for the evaluation of the anti-tumor effect of human IL-12 and B7-1. All data indicated that the combination of hIL-12 and hB7-1 gene might be a promising approach for in vivo cancer therapy.

Key words     tumor; hIL-12; hB7-1;
HuPBL-SCID mice; gene therapy

Received: December 30, 2002       Accepted:
March 7, 2003

This work was supported by the grants from
the National Natural Science Foundation of China (No. 39600172, No. 30171055)

*Corresponding author: Tel, 86-21-25067154;
e-mail, [email protected]

人IL-12和B7-1基因对HuPBL-SCID小鼠模型中人源肿瘤的协同抑制作用

高军* 赵平¹ 陈秀华² 李茂 龙建秋 谷爱梅 吴晓兰 曹广文¹ 戚中田¹

（ 海军医学研究所流行病学研究室，
上海200433； 1第二军医大学微生物学教研室，
上海 200433； 2上海市医药工业研究院药理研究室，
上海 200040）

摘要       人IL-12（hIL-12）对鼠源的免疫细胞作用较弱， 进行hIL-12抗瘤研究缺乏有效的动物模型。 为此利用荷人瘤的HuPBL-SCID小鼠模型， 将改良的Winn assay细胞免疫功能分析方法应用于评价hIL-12和hB-1协同抗瘤作用。
用商业化的非脂质转基因试剂配制单独的hIL-12、hB7-1或hIL-12联合hB7-1的基因转染液。 将上述三种基因转染液分别瞬时转基因入人恶性黑色素瘤A375细胞， 转基因30 min后， 按组别（hIL-12组、hB7-1组、hIL-12+hB7-1组、rhIL-2对照组、HuPBL对照组和肿瘤对照组）同人外周血淋巴细胞混合接种于SCID小鼠皮下， 20天后处死实验小鼠， 测得hIL-12和hB7-1的抑瘤率分别为74.06%和66.98%， 联合作用达93.40%， rhIL-2和HuPBL对照组无抗瘤作用。
同时， 在此模型上hIL-12联合hB7-1基因对人大肠癌LoVo和人肺癌SPC的抑制率分别为98.37%和97.39%。 实验建立的各组HuPBL-SCID小鼠20天的外周血都含有人IgG（>0.5 mg/L）和极少量人CD3+淋巴细胞(>0.5个/100个有核细胞)。 hIL-12、hB7-1和hIL-12+hB7-1组的瘤灶内人淋巴细胞浸润生长，
肿瘤细胞残存， 而rhIL-2和HuPBL对照组的瘤灶内人淋巴细胞“似团样”生长， 肿瘤生长旺盛。
表明此HuPBL-SCID小鼠模型上的抗瘤机制为局部免疫反应。 结果表明以此动物模型可跨越种属差异造成的实验障碍，
证明了hIL-12和hB7-1联合应用在HuPBL-SCID小鼠模型中具有显著的协同抗瘤效果。

关键词   肿瘤； hIL-12； hB7-1； HuPBL-SCID小鼠； 基因治疗

人白细胞介素12（hIL-12）是由一个二硫键连接的异二聚体分子， 主要由活化的B细胞、激活的单核细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞（APC）分泌。 重组的IL-12(rIL-12)在动物实验和Ⅰ期临床试验中抗瘤作用明显，
但Ⅱ期临床试验中显示了消化道出血、哮喘和肝功能受损等副作用。 有分析认为是由于注射给药使得循环血液中IFN-γ升高所致。 预注射一次IL-12可降低全身的副作用， 但可能也降低IL-12的抗瘤效果， 同时给临床应用安全也带来问题[1]。 应用IL-12进行肿瘤局部的基因治疗可使治疗部位IL-12浓度升高， 诱发局部IFN-γ的升高， 激发原位识别和杀伤肿瘤的免疫反应，
又可大大降低IL-12的全身副作用。 人共刺激分子B7-1（hB7-1）一般存在于活化的B细胞、激活的单核细胞、树突状细胞等APC细胞表面。 在APC细胞活化T细胞过程中， B7-1同T细胞表面的CD28结合可作为第二刺激信号协同激活T细胞。 IL-12或B7-1基因治疗肿瘤均已获准临床实验，
但目前研究结果表明疗效均有待提高[2]。 另外还没有见到有关两个基因联合治疗应用的临床研究报道，
而较多动物实验结果表明两者联合应用具有协同抗瘤作用， 显示了更好的临床应用前景[3,4]。

因hIL-12对鼠类作用较弱， 评价IL-12和B7-1协同抗肿瘤的研究多为鼠的IL-12和人/鼠的B7-1治疗鼠源肿瘤， 缺乏hIL-12对人肿瘤的疗效评价。 实验中采用改良的分析细胞免疫功能的Winn assay方法[5,6]， 将人外周血淋巴细胞（HuPBL）与瞬时转基因的人肿瘤细胞混合接种于联合免疫缺陷症（SCID）小鼠皮下， 即建立HuPBL-SCID小鼠模型， 在较为全面地分析了hIL-12或hB7-1基因单独作用和联合作用抗人黑色素瘤A375的效果及免疫抗瘤机制后， 又以此动物模型评价了hIL-12和hB7-1联合转基因协同抗人大肠癌LoVo和人肺癌SPC的效果， 为此治疗方案提供更为接近临床的实验依据。

1    材料和方法（Materials and
Methods）

1.1   材料

hIL-12的 p40、p35片段和hB7-1 的cDNA由海军医学研究所流行病学研究室从上海地区人骨髓有核细胞中克隆获得，
以真核表达载体pCI(购于Promega公司)为骨架，
分别构建了表达hIL-12和hB7-1的质粒pCI-hIL-12和pCI-hB7-1[7]， 其中连接p40和p35的内核糖体进入位点序列（IRES）由第二军医大学微生物教研室自备， 载体基因结构见图１。 测定hIL-12的ELISA试剂盒购自Bender公司； 抗人CD3和hB7-1分子的流式专用荧光抗体购自Caltag公司； 细胞因子rhIL-2购自Endoeng公司； 非脂质转染试剂(effectene transfection reagent)和抽提质粒DNA试剂盒购自Qiagen公司。 裸鼠传代的人黑色素瘤细胞株A375由上海医药工业研究院提供； 裸鼠传代的人大肠癌LoVo和人肺癌SPC瘤株及SCID小鼠（沪动合证字133号）购自上海肿瘤研究所， SCID小鼠雌雄不拘， 平均体重为(17.8±0.5) g； 实验动物操作和喂养委托上海医药工业研究院完成。

Fig.1The structure of pCI-hIL-12 and
pCI-hB7-1

1.2   转基因制剂的配制

按说明书操作，
采用Effectene(μL)∶Enhancer(μL)∶DNA(μg)=13∶8∶1比例， 用pCI-hIL-12配制hIL-12的转染液， 用pCI-hB7-1配制hB7-1转染液， 联合应用两者(1∶1)配制联合转染液。 用试剂盒指定具体缓冲液调整DNA浓度， 单基因转染组为6 mg/L， 联合组为12 mg/L。 同时， 按配制转染液时所用试剂的浓度，
但不加入表达载体DNA， 配制用于动物实验对照的单纯转染液。

1.3   转基因制剂的体外转染和直接细胞毒性观察

将人黑色素瘤细胞株A375体外培养传代稳定后， 以1×106个／孔的细胞密度铺于36
mm直径的六孔板。 设三组： pCI-hIL-12的转染组、pCI-hB7-1转染组和联合转染组， 用1.2中配制的三种基因转染液167 μL/孔对应各组分别转基因（按说明书操作）， 72 h后用ELISA测定细胞培养上清液IL-12含量， 同时分别取各组细胞0.5×106个， 加入FITC标记的抗人CD80抗体0.5 μg， 按常规方法用流式细胞仪（Coulter EPICS XL）检测表达B7-1的细胞表达率。 另在一平行实验中，
细胞转基因后不更换培养基， 持续培养10天后镜检观察细胞的生长状况， 测定转染液对细胞的毒性反应。

1.4   抗瘤效率的实验检测

1.4.1       抗人黑色素瘤A375 的动物实验        30只SCID小鼠分为六组： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组（pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375）； (2) pCI-hIL-12组（pCI-hIL-12+rhIL-2+HuPBL+A375）； (3) pCI-hB7-1组（pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375）；
（4）rhIL-2对照组（rhIL-2+HuPBL+A375）； (5)HuPBL对照组（HuPBL+A375）和(6)A375对照组（A375细胞）。 取生长良好的SCID小鼠传代的A375瘤块， 用生理盐水制备A375细胞悬液。 同时，
取健康献血员200 mL鲜血， 以淋巴细胞分离液常规分离制备HuPBL。 将2×106个A375细胞分别与0.1 mL三种新配制的转染液混合，
37 °C培育30 min后， 再与1.5×107个HuPBL悬液混合，
按组别每只小鼠腋皮下接种0.2 mL。 接种日起除HuPBL对照组和A375对照组外， 另四组实验小鼠均隔日腹腔注射rhIL-2 500 u/只， 共10次。
接种20天后快速脱颈处死实验动物。

1.4.2       抗人大肠癌LoVo及人肺癌SPC的动物实验     转基因策略对这两种肿瘤的抗瘤作用的评价分别用24只SCID小鼠。 各为四组： pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组（pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+肿瘤细胞）、转染液对照组（单纯转染液+肿瘤细胞）、HuPBL对照组（HuPBL+肿瘤细胞）和肿瘤细胞对照组。 肿瘤细胞分别为LoVo或SPC。 只有pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组注射rhIL-2， 淋巴细胞的制备、瞬时转基因及肿瘤细胞接种等均同前A375的操作， 接种25天后脱颈处死动物。

1.4.3       抗瘤效果评价方法       每周用游标卡尺测肿瘤大小二次。
实验小鼠处死后， 瘤块称重， HE染色病理分析， 抗人CD3抗体组化染色人淋巴细胞。 根据公式(1)、 （2）、 (3)计算相关实验数据。 协同效应根据Webb氏分数乘积法计算判定见统计学处理见公式(3)。

                                                                                                                           
(1)

V， 肿瘤体积； a， 瘤块长径； b， 瘤块短径

抑瘤率（%）=[(肿瘤对照组平均瘤重－给药组平均瘤重)/肿瘤对照组平均瘤重]×100%         (2)

1.4.4       HuPBL-SCID小鼠模型的有效性分析        A375实验小鼠眼球取血， 用ELISA法测定血浆中人免疫球蛋白的含量。 之后将各实验小鼠血细胞组内合并， 涂片镜检淋巴细胞数，
并用流式细胞仪检测人CD3+T细胞数。

1.5   统计学处理

实验数据经过正态性及方差齐性检验后，
用Dunnett-t检验处理各实验组同对照组之间的均数差别， 设双向检验水准α=0.01， 判定各实验组与对照组的统计差异。
协同作用的判定依据Webb氏分数乘积算法[8][公式(3)]：

(fa)1,2 =1－[1－(fa)1 ][1－(fa)2 ]                                                                                           (3)

(fa)1和(fa)2分别为实验测定的两种疗法的抑瘤率， (fa)1,2为两种疗法叠加效应的理论计算值，
如果合并应用两种疗法的实验测定值大于理论计算值， 则表示具有协同作用。

2结果（Results）

2.1   转染液的体外转染A375效率评价和直接细胞毒性观察

hIL-12、hB7-1和hIL-12+hB7-1三种转染液分别转染A375细胞72 h后， ELISA检测hIL-12的表达量(单位：
μg/L，
指10⁶个细胞的72 h培养上清液中所含的蛋白质的浓度)分别为1.2±0.06、低于检测阈、1.1±0.08；
流式细胞仪分析hB7-1的细胞表达率分别为1.01%、56.60%、61.80%， 相对荧光强度分别为2.19、2.84、3.01。
结果表明配制的转染液具有高效的转基因作用， 并且pCI-hIL-12和pCI-hB7-1两载体联合应用互不影响各自的转染能力。

细胞毒性实验结果判定依靠镜检细胞生长状况，
比较含转染液培养基与常规培养基培育的细胞生长状况差异。 观察发现两者在培养10天的过程中， 无对比差异。
表明转染液无直接细胞毒作用。

2.2   转基因的抗瘤效果

2.2.1       转基因抗人黑色素瘤A375         各组转基因处理的人体黑色素瘤A375细胞同HuPBL混合接种SCID小鼠皮下后， 0至14天间，
肿瘤生长不明显， 各组无显著差异。 14至20天间， 各组肿瘤生长出现明显差异。
第20 天各组肿瘤的平均体积（mm³）： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为44.1±43.3； (2) pCI-hIL-12组为575.5±671.1； (3) pCI-hB7-1组为651.4±786.6； （4）rhIL-2对照组为1964.0±610.7； (5)HuPBL对照组为1726.6±459.2； (6)A375对照组为1849.0±414.4。
肿瘤体积动态差别见图2(A)。 快速处死动物后分离肿瘤组织，
测得平均瘤重(g)： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为0.28±0.18； (2) pCI-hIL-12组为1.10±1.26； (3)
pCI-hB7-1组为1.40±1.33；
（4）rhIL-2对照组为4.60±0.88； (5)HuPBL对照组为4.12±1.17； (6)A375对照组为4.24±0.94。
瘤重差别的统计分析见图3（A）。
依瘤重计算获得： hIL-12或hB7-1转基因对移植于SCID小鼠的人体黑色素瘤A375的抑瘤率分别为74.06%和66.98%， 而hIL-12+hB7-1联合转基因的抑瘤率达93.40%。 hIL-12、hB7-1二者两种疗法叠加效应的理论计算值根据公式(3)计算得到为91.43%， 而本试验hIL-12+hB7-1联合应用的实际抑瘤率大于计算的理论相加值，
表明二者能协同抗瘤。

Fig.2       The curve
of tumor growth in HuPBL-SCID

2×10⁶ tumor cells transfected and followed mixture with
1.5×107 HuPBL were implanted into a SCID mouse subcutaneous. The volume of
tumors was measured every 2 days. (A) A375 ( n=5); (B) LoVo (n=6); (C)
SPC (n=6).

Fig.3       The effect
of hIL-12 and hB7-1 on the weight of tumor A375, LoVo, SPC inducing by the
implanting of A375, LoVo, SPC respectively

Mice were injected s.c. with 1.5×107HuPBLs and with 2×106 tumor cells modified
by hIL-12, hB7-1, hIL-12 and hB7-1 genes. The average weight of tumors was
calculated after they were quickly sacrificed. (A) The mice were injected with
A375 tumor cells modified by different genes, followed by i.p. inoculation of
rhIL-2 (500 u per SCID mouse) every other day except the group 5 and 6, then
sacrificed after 20 d. 1, pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group; 2,
pCI-hIL-12+rhIL-2+HuPBL+A375 group; 3, pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group; 4,
rhIL-2+HuPBL+A375 control; 5, HuPBL+A375 control; 6, A375 control. (B) The mice
were injected with LoVo or SPC tumor cells. The mice in group 1 were
transfected by hIL-12 and hB7-1 genes, and followed by i.p. inoculation of
rhIL-2 (500 u per SCID mouse) every other day , then sacrificed after 25 d. The
other groups were different controls. 1, pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL
+LoVo or +SPC group; 2, blank transferring solutions without genes hIL-12 and
hB7-1 +LoVo or +SPC control; 3, HuPBL +LoVo or +SPC control; 4, LoVo or SPC
control. *[KG-*3〗P<0.01 vs. control. #P<0.01 vs. hIL-12 alone or hB7-1 alone.

2.2.2       转基因抗人大肠癌LoVo或肺癌SPC         各组转基因处理的人体大肠癌LoVo和肺癌SPC细胞同HuPBL混合接种SCID小鼠皮下后， 0至14天间，
肿瘤生长不明显， 各组无显著差异。 14至25天间， 各组肿瘤生长出现明显差异。
人体大肠癌LoVo第25天的各组肿瘤平均体积（mm³）： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为0.33±0.26； (2) 转染液对照组为1381.0±450.6； (3) HuPBL对照组为2889.7±831.7； (4) 肿瘤细胞对照组为2632.8±1065.1。 人体肺癌SPC第25天的各组肿瘤平均体积： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为0.50±0.00； (2) 转染液对照组为701.9±243.7； (3) HuPBL对照组为1325.2±713.4； (4) 肿瘤细胞对照组为1229.4±474.9。 肿瘤体积差异分别见图2(B)和2(C)。 处死动物后分离肿瘤组织， 测得人体大肠癌LoVo的平均瘤重(g)： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为0.05±0.00； (2) 转染液对照组为3.00±0.57； (3) HuPBL对照组为2.92±0.39； (4) 肿瘤细胞对照组为3.07±0.73。 测得人体肺癌SPC的平均瘤重(g)： (1) pCI-hIL-12+pCI-hB7-1组为0.05±0.00； (2) 转染液对照组为1.92±0.18； (3) HuPBL对照组为1.97±0.22； (4) 肿瘤细胞对照组为1.92±0.19。 瘤重差别的统计分析见图3(B)。 依瘤重计算获得： hIL-12+hB7-1联合转基因对人体大肠癌LoVo和肺癌SPC的抑瘤率分别为98.37%和97.39%。 LoVo实验小鼠及肿瘤照片见图4。

Fig.4       The
HuPBL- SCID mice implanted with LoVo (A) and their corresponding tumors (B)

1, pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+LoVo
group; 2, transferring solutions without pCI-hIL-12 or pCI-hB7-1 +LoVo control;
3, HuPBL +LoVo control; 4, LoVo control.

2.3   肿瘤组织病理分析和人淋巴细胞组化染色

从人黑色素瘤A375实验肿瘤组织的HE染色切片可见： hIL-12、hB7-1和hIL-12+hB7-1的瘤灶内人淋巴细胞浸润生长，
肿瘤细胞只有部分残存[图5（A）]； 而hIL-2和HuPBL对照组的瘤灶内人淋巴细胞似“团样”生长， 与生长旺盛的肿瘤细胞分界明显[图5（B）]。 从抗人CD3抗体组化染色切片可见： 转基因治疗组瘤灶内浸润的淋巴细胞多数为人CD3+T细胞[图5（C）]。

Fig.5       HE and
immunohistochemical staining of the tumor tissue in A375 experiment

(A) HE staining of the tumor tissues in
pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group or pCI-hIL-12+rhIL-2+HuPBL+A375
group or pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group. The arrow indicates many
lymphocytes infiltrate into the tumors (100×). (B) HE staining of tumor tissues
in rhIL-2+HuPBL+A375 or HuPBL+A375 control. The arrows indicate some
lymphocytes like ‘a small mass’ grow separately in the tumors (40×). (C)
Immunohistochemical staining of the tumor tissues using human CD3 monoclonal
antibody in pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group or
pCI-hIL-12+rhIL-2+HuPBL+A375 group or pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375 group. The
arrows indicate human T lymphocytes exist in the tumors (400×).

2.4   HuPBLs-SCID小鼠模型有效性分析

对人体黑色素瘤A375实验小鼠的免疫球蛋白含量进行测定。 结果发现本实验建立的HuPBL-SCID小鼠外周血均含有一定量的人IgG蛋白（图6），
外周血镜检结果发现100个有核细胞中可见0.5～2个淋巴细胞。
用荧光标记的抗人CD3抗体染色流式细胞仪检测发现HuPBL-SCID小鼠外周血均有极少量人CD3+细胞存在（图7）。 统计结果显示上述检测指标各组HuPBL-SCID动物之间无统计学差异； 但同A375肿瘤对照组之间均存在显著差异（P<0.01， n=5）。 这些结果表明，
本研究建立的HuPBL-SCID小鼠模型体内存在一定程度的人免疫反应。

Fig.6       Human IgG
in the peripheral blood of SCID mice in A375 experiment

Human IgG (>0.5mg/L) were
detected in all HuPBL-SCID mice in A375 experiment by ELISA .*P<0.01 vs. A375 control.

Fig.7       Detection
of human CD3+ lymphocytes in peripheral blood of SCID mice using the flow
cytometer in A375 experiment

Human CD3+T cells (>0.5 cell/100 nucleated
cells) were detected in all HuPBL-SCID mice, but not A375 control using the
flow cytometer. A375 control is the SCID mice only implanted with tumor A375
cells. HuPBL control represented rhIL-2+HuPBL+A375 control or HuPBL+A375
control. hIL-12+hB7-1 group represented pCI-hIL-12+pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375
group, or pCI-hIL-12+rhIL-2+HuPBL+A375 group, or pCI-hB7-1+rhIL-2+HuPBL+A375
group.

3讨论（Discussion）

目前认为IL-12抑瘤机制可能为多重性： 依赖局部CD4+/CD8+细胞的免疫反应； 增强已活化的CD8+细胞功能； 直接活化特殊NK细胞亚群[9]； 提高局部IFN-γ水平； 通过IFN-γ诱生蛋白质间接抑制肿瘤血管生长。 但在一些IL-12抗瘤效果不佳的实验中发现， IL-12激发的众多效应细胞却不能识别杀伤细胞表面缺乏B7-1共刺激分子的肿瘤细胞。 在单独转基因表达B7-1分子的肿瘤基因治疗实验中， 出现两种实验结果： 一种为肿瘤免疫原性增强， 成瘤性降低； 另一种为抑制或不影响肿瘤免疫原性，
肿瘤生长旺盛。 普遍认为这样的B7-1基因治疗效果由各实验所用的不同肿瘤模型造成， 但也有报道即使用B7-1基因修饰同一种B16细胞， 仍然存在这两种结果， 原因有待深入研究。 然而众多实验表明B7-1可协同IL-12杀瘤， 而且Heise等[10]实验证明肿瘤细胞表达B7-1分子是IL-12杀瘤的必需条件。

IL-12和B7-1两者联合应用有两种方式：
一种为 B7-1转基因， 重组IL-12蛋白全身注射应用作为免疫佐剂， 但IL-12毒副作用大，
不利于将来临床应用； 另一种为两者共同转基因， 以此进行的ex vivo和in vivo基因治疗更有临床前景。 转基因载体的构建有逆转录病毒、腺病毒和单纯质粒型真核表达载体，
由于病毒型载体存在固有的毒副作用， 从安全有效方面考虑，
应用单纯质粒型载体更适宜用于人体基因治疗。 本实验将分别表达hIL-12和hB7-1的质粒型载体（1∶1）联合应用，
表明具有良好的协同抗瘤效果。 虽然有研究应用含三顺反子共表达IL-12的p40、p35和B7-1的单一载体[11]， 但在原位转基因时应用独立表达IL-12和B7-1的载体有其独特的优点： (1)原位转基因提供局部的免疫微环境， 无需将共表达的基因在同一细胞内表达，
联合应用两个独立表达的载体更为接近体内免疫反应环境中的自分泌和旁分泌调节机制； （2）联合应用两个独立表达的载体可人为调节两个基因的比例和用量，
使基因治疗效果更为明显， 可最大限度地避免IL-12过量表达引起的毒副作用， 比单一载体依靠投入量和启动子的强弱来调节基因表达更为精细。

人IL-12对鼠的淋巴细胞无作用， 许多IL-12的抗瘤实验结果是对鼠的IL-12进行动物实验获得的， 为了准确评价人IL-12的功能需要选用恰当的动物模型。 Winn assay方法可用于定量检测同种异体淋巴细胞的抗瘤细胞免疫功能，
通常将异源待检淋巴细胞和肿瘤细胞混合移植入小鼠体内， 检测成瘤率、肿瘤生长情况及动物生存时间，
以此评价淋巴细胞的功能[5]。 有三种移植方法： (1)细胞混合注入小鼠腹腔；
(2)肿瘤接种， 淋巴细胞静脉输注； (3)细胞混合接种于皮下。 在用HuPBL-SCID动物模型来评价人淋巴细胞抗瘤细胞免疫功能时， 许多研究结果表明前两种方法移植的人PBL细胞无抗瘤活性[12,13]。 Iwanuma 等[6]认为，
当腹腔和静脉内接种人淋巴细胞时， 因接种的人淋巴细胞大量接触小鼠的异种抗原，
而限制了其与接种的肿瘤细胞的接触， 存在一定程度的免疫耐受。
他们将人淋巴细胞和人肿瘤细胞混合皮下接种， 增加了彼此之间的接触，
使免疫反应局限化， 发现无论自体或异体（相对肿瘤细胞而言）的PBL细胞均有剂量依赖的抗瘤作用。 本实验主要依靠这种局限化后的剂量依赖抗肿瘤作用机制， 来评价hIL-12和B7-1对移植的HuPBL抗瘤作用的增加程度和联合协同作用。 在确立本实验的评价体系前，
我们进行了预实验滴定HuPBL和肿瘤细胞的大体用量范围， 使剂量依赖的抗瘤作用在实验中较易观察到，
而不因单个转基因的抗瘤效果已达到上限， 使联合应用的协同作用不能被有效检测到。
预实验发现当接种2×106个A375细胞， 约以400∶1以上的效靶比例混合接种HuPBL细胞， 即使无转基因治疗， 肿瘤一般不能生长； 以5∶1以下的效靶比例接种， 即使增加基因投入量， 治疗效果也不明显。 据此， 同时参考文献[6]报道的每只小鼠接种量（肿瘤细胞2×106， HuPBL细胞2×107，
效靶比例为10∶1），
确定本实验的每只小鼠接种量（肿瘤细胞2×106， HuPBL细胞1.5×107，
效靶比例为7.5∶1），
结果表明依此接种比例可较好检测到hIL-12和hB7-1的 in vivo协同抗瘤作用。

实验中测得HuPBL-SCID小鼠外周血均含有人IgG和极少量的人CD3+淋巴细胞， 同时所有HuPBL过继组的肿瘤组织内有大量的CD3+人淋巴细胞浸润， 表明人免疫反应存在于动物模型中。
但在无基因治疗组内， 淋巴细胞成“团块”样生长，
同肿瘤细胞之间分界明显， 每只动物均显出无抗瘤效果；
而在基因治疗组内， 淋巴细胞一般浸润入肿瘤细胞之间，
多数动物抗瘤效果明显。 分析推测在无hIL-12和hB7-1的基因治疗时， 同肿瘤细胞混合接种的人淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力是有限的，
或因大量接触抗原， 甚至出现细胞免疫耐受（本研究采用效靶比例较低， HuPBL组几乎没有观察到抗瘤作用， 可能存在细胞免疫耐受）； 而hIL-12和hB7-1基因治疗可阻止这种耐受， 增强HuPBL的杀瘤作用， 这也可能是免疫基因治疗肿瘤的重要机制之一。
但体液免疫反应似乎不受这两种基因治疗的影响， 其机制有待进一步研究。

本实验在荷人瘤的HuPBL-SCID小鼠模型上， 利用改良的Winn assay细胞免疫功能分析方法评价瞬时转基因治疗肿瘤效果， 虽然同临床原位基因治疗应用有一定的差距，
但对于生物活性具有种属差异的免疫调节因子（如IL-12）， 在临床前活体上评价基因治疗效果有一定的实验障碍时，
此法可跨越了种属差异造成的实验障碍， 为临床前准确地评价hIL-12和hB7-1联合协同抗瘤效果提供更为科学的数据。

感谢联科生物有限公司的谢严和仲维学博士在流式细胞仪检测中给予的帮助。

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收稿日期：
2002-12-30      接受日期： 2003-03-07

国家自然科学基金资助项目（No.
39600172， No. 30171055）

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