https://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN 0582-9879                             ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(6): 548-553                             CN 31-1300/Q

Exogenous Expression of SOCS
Box-deficient Mutant ASB-8 Suppresses the Growth of Lung Adenocarcinoma SPC-A1
Cells

LIU Yong-Zhong, LI Jin-Jun*, ZHANG Feng-Rui, SHEN Yan1, YAO
Ming, WAN Da-Fang, GU Jian-Ren*

( State
Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Shanghai Jiao Tong University
Cancer Institute, Shanghai 200032, China; ¹Shanghai Research
Center of Biotechnology, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200233,
China  )

Abstract        ASB-8
is a new member of the human ankyrin repeat and SOCS box containing protein
family (ASB). This report deals with the expression of ASB-8 protein in lung
carcinoma tissue, as well as its biological effect on the proliferation and growth
of lung cancer cell line SPC-A1. ASB-8 was  expressed in pT7-450 expression vector, and an anti-ASB-8
rabbit polyclonal antibody was prepared. The expression of ASB-8 protein in
lung carcinoma tissue was detected using immunohistochemistry. The growth
characteristics of the lung adenocarcinoma SPC-A1 cells expressing either
exogenous ASB-8 or ASB-8ΔSB (SOCS box-deficient) was studied by both in vitro cell
growth curve and in vivo nude mouse tumor formation assay.
Immunohistochemical staining detected positive reaction of 96.8% (30/31)
showing that ASB-8 was highly expressed in lung cancer tissues; however, the
expression of ASB-8 was lower, or even no expression in noncancerous lung
tissues. Significant growth inhibition was observed in SPC-A1 cell line
expressing ASB-8ΔSB on day 4 and persisted to day 6, compared with mock
transfected cells (P<0.01). No difference in the growth properties was observed between ASB-8 and mock transfected cells. In vivo study also showed that tumor formation of ASB-8ΔSB expressing cells was significantly inhibited as compared with that of the control group (P<0.01). Therefore, ASB-8 may play an important role in growth and proliferation of lung cancer, possibly as positive regulator.

Key words     ASB-8 gene; ankyrin
repeat; SOCS box; lung cancer

Received: January 24, 2003   Accepted: March 28, 2003

This work was supported by the grants from
the Major State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No.
G1998051209) and the National High Technology Research and Development Program
of China (863 Program) (No. 2001AA227121, No. 2001AA221141)

*Corresponding author: Tel,
86-21-64047029-1102; Fax, 86-21-64177401; e-mail, [email protected]

人新基因ASB-8 SOCS盒缺失突变体抑制肺癌细胞生长

刘永忠 李锦军* 张锋锐 沈雁1 姚明 万大方 顾健人*

( 上海交通大学肿瘤研究所、癌基因及相关基因国家重点实验室， 上海 200032；1中国科学院上海生物工程研究中心， 上海 200233 )

摘要       ASB-8是新近发现的含锚蛋白重复序列和细胞因子信号抑制物盒蛋白质家族新成员（human
ankyrin repeat and SOCS box containing protein family, ASB family）。 研究观察了人ASB-8在肺癌中的表达及对肿瘤细胞生长的影响。 利用制备的ASB-8多克隆抗体和免疫组化技术， 分析了人ASB-8在肺癌组织中的表达； 构建ASB-8及其SOCS盒缺失突变体（ASB-8ΔSB）的真核表达载体， 转染至人肺腺癌细胞系SPC-A1中并检测外源基因的表达； 通过体外细胞生长曲线、裸鼠体内成瘤试验， 观察ASB-8及其缺失突变体对SPC-A1细胞生长的影响。 免疫组化结果表明： ASB-8蛋白在肺癌组织中高表达， 阳性率为96.8%（30/31），
而在癌旁肺和正常肺组织低表达或不表达， 弱阳性率仅为25.8%(8/31)； 转染ASB-8ΔSB的SPC-A1肺癌细胞的增殖速度显著慢于对照组细胞(P<0.01)， 而转染ASB-8的肺癌细胞没有明显的生长特性改变； ASB-8 SOCS盒缺失突变体对SPC-A1的体内生长及肿瘤形成有一定的抑制作用(P<0.01)。 ASB-8基因可能是一种与人肺癌发生发展相关的新基因。

关键词   ASB-8基因; 锚蛋白重复序列; SOCS盒; 肺癌

细胞因子信号抑制物（suppressor of cytokine signaling， SOCS）蛋白质家族是新近发现的一类对细胞因子或激素信号转导具有负调控效应的调控蛋白质，
这种抑制效应依赖于该类蛋白质氨基端的SH2结构域和SOCS 盒（SOCS box）。 研究表明， 该家族蛋白质的氨基端和SH2结构域可与JAK激酶或特定细胞因子受体结合； 羧基端的SOCS盒可以作为接头而与延伸蛋白(elongin)
B/C依赖性的遍在蛋白化复合体相互作用， 最终可能导致SOCS靶向的蛋白质降解[1～5]。
该蛋白质家族在细胞的众多正常生理活动或生化反应中起着非常重要的作用。 目前， 除SOCS蛋白外， 另一些含有SOCS 盒的蛋白质家族也陆续被克隆， 主要包括ASB、SSB、WSB和 RAR样蛋白质家族； 它们的氨基端或中部分别含有锚蛋白重复序列（ankyrin repeat）、SPRY、WD-40和GTPase 结构域， 而羧基末端含SOCS盒[6]。 有关这些蛋白质的功能尚不清楚。
人含锚蛋白重复序列和细胞因子信号抑制物盒蛋白-8（human ankyrin repeat and SOCS box
containing protein-8, ASB-8）基因（AF464877）是本实验室从人胎肝文库中分离到的ASB家族新成员[7]。 序列分析表明， ASB-8含2545 bp, 有较完整的3′端和5′端， 编码288个氨基酸。 同源比较发现，
该基因编码的蛋白质和小鼠ASB-8在全蛋白质水平上有96%的同源度。

本研究在发现ASB-8在肺癌组织中表达上调的基础上， 观察了ASB-8及其SOCS缺失突变体对人肺癌细胞SPC-A1的生长的调节作用。 结果显示， 该基因SOCS缺失突变体的表达可显著抑制人肺癌细胞SPC-A1的生长； 这提示ASB-8可能在人肺癌的发生发展中起着重要的生物学作用。

1    材料和方法(Materials and
Methods)

1.1   材料

1.1.1       细胞系及主要试剂       SPC-A1、A549、 NCI-H446人肺腺癌细胞购自中科院生物化学及细胞生物学研究所细胞库；
真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His B(－)、
脂质体LipofectAMINE 试剂， Top10F′菌株和抗Myc标签的单克隆抗体购自Invitrogen公司； G418、新生牛血清和DMEM培养基购自Gibco BRL公司； pT7-450载体和大肠杆菌表达菌株HMS174(DE3)由中科院生物工程中心提供； 过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG为Santa Cruz公司产品； BCA试剂盒和MTT
[3-(4,5)-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphe-nyl tetrazolium bromide]为Sigma 公司产品； Super-Signal试剂盒为Pierce公司产品； EnVision system kit购自DAKO公司； T4连接酶、BamHI、EcoRI和HindIII 限制性内切酶均为Promega公司产品； 所有引物的合成和测序由上海基康生物工程公司完成。 SPF级6周龄雄性BALB/c裸小鼠由上海市肿瘤研究所实验动物室提供， 动物实验在SPF级动物实验室进行。

1.1.2       肿瘤组织标本       31对肺癌标本及癌旁组织取自广东省呼吸疾病研究所和复旦大学附属肿瘤医院临床手术切除组织， 其中肺腺癌6例，
鳞癌22例，
小细胞肺癌1例，
肺泡癌2例； 1例正常肺组织取自意外事故死亡者。

1.2   方法

1.2.1       重组质粒的构建    分别合成含EcoRI和BamH1酶切位点的上下游引物F1， 5′-CGGAATTCGCCATGGGTTCCAGTAT-3′; F2, 5′-CGGGATCC-CGTTCTAAAAGTAACAGG-3′和F3, 5′-CGGGATCCAGCTGCGGGTCTCTGG-3′,以pCMVScript-ASB-8质粒为模板， F1和F2为引物扩增ASB-8编码区， F1和F3为引物扩增编码区的1～235氨基酸（缺失SOCS 盒）， 酶切后连接到pcDNA3.1/Myc-His B(-)真核表达载体上， 转化Top10F′受体菌， 得到阳性克隆pASB-8-Myc-His、 pASB-8ΔSB-Myc-His， 经测序验证。

1.2.2       细胞培养与转染    SPC-A1、A549、NCI-H446 肺癌细胞在5% CO2， 37 ℃条件下培养于含10%新生牛血清的DMEM中。 在每个30 mm的细胞培养平皿（NUNC）中接种2×105个SPC-A1细胞， 接种24 h后， 分别取1 μg
pASB-8-Myc-His, pASB-8ΔSB-Myc-His和空载体质粒pcDNA3.1/Myc-His B(-) 转染细胞， 转染方法参照LipofectAMINE试剂操作指南。 48 h 后， 加入含G418 (600 mg/L)新鲜DMEM培养基筛选稳定转染和表达细胞， 将出现的抗性细胞克隆扩大培养， 最后用Western 印迹证实。

1.2.3       SDS-PAGE及Western 印迹         首先用灭菌PBS轻缓洗涤接近100%汇合度的单层细胞两次， 再用细胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5、140 mmol/L NaCl、 10% 甘油、1% Nonidet
P-40、100 mmol/L
NaF、200 mmol/L
NaVO5、 1 mmol/L
PMSF)悬浮细胞， 冰浴培育30 min， 12 000 r/min离心3 min， 取上清液， 用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。
每个样品取30 μg 的蛋白质，
用10% SDS-PAGE电泳， 半干式电转移法转至硝酸纤维素膜；
原核表达的ASB-8蛋白直接经10% SDS-PAGE电泳后， 考马斯亮蓝染色和Western印迹检测。 室温下用50 g/L脱脂奶粉封闭非特异性反应1 h。 检测SPC-A1细胞中外源性表达的ASB-8和ASB-8ΔSB， 用抗Myc标签的单克隆抗体4 ℃下反应过夜， 过氧化物酶标记的兔抗鼠 IgG为第二抗体37 ℃反应1 h；
检测细胞系中内源性ASB-8， 用ASB-8多克隆抗体4 ℃下反应过夜， 过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG为第二抗体37 ℃反应1 h； 4 ℃下反应过夜的样品最后用SuperSignal显色系统显色。

1.2.4       转染细胞生长曲线测定       将生长状态良好的细胞， 分散后制成单细胞悬浮液， 按每孔1.5×103个细胞的密度接种于96孔细胞培养板中， 接种并将开始贴壁生长的当天定为0天， 每隔24 h为一个检测点， 用MTT试验法连续测定6天的细胞增殖状况。 测定时每孔加入10 μL的 MTT（5 g/L）(Sigma)， 4 h后弃去培养液，
加入150 μL 的DMSO溶解蓝紫色结晶， 待其经振荡充分溶解后每孔各取100 μL移至新的酶标板， 于540 nm波长处测定光吸收值， 取3个孔的均值。

1.2.5       BALB/c裸小鼠成瘤实验      将SPF级6周龄雄性BALB/c裸小鼠随机分为3组， 每组5只。 第一组接种转染pASB-8-Myc-His的SPC-A1细胞； 第二组接种转染pASB-8ΔSB-Myc-His的SPC-A1细胞； 第三组为对照组， 接种转染pcDNA3.1/Myc-His B()空载体的SPC-A1细胞； 每只小鼠前驱体侧皮下接种6×106个细胞， 5周后无痛苦处死小鼠，
取其皮下移植瘤组织称重， 比较其不同处理组间差异。

1.2.6       人ASB-8多克隆抗体制备和免疫组织化学       分别合成带有EcoRI和HindIII的上下游引物5′-AGAATTCATGAGTTCCAGTATG-3′， 5′-TCTTAA-GCTTCTATTCTAAAAG-3′；
扩增ASB-8编码区并克隆至pT7-450载体中， 转化pT7-450-ASB-8基因的HMS174(DE3)菌株经IPTG诱导并制备包涵体， 经尿素溶解并进行SDS-PAGE 电泳后， 用0.25 mol/L的KCl浸泡SDS-PAGE胶， 切胶并纯化ASB-8蛋白， 作为免疫原常规方法免疫健康的新西兰大白兔，
制备兔抗ASB-8多克隆抗体。

对SPC-A1肺腺癌细胞系制备成单层细胞爬片后进行免疫细胞化学检测。 所有用于免疫细胞化学和免疫组化检测的细胞和组织样品均用10%中性缓冲甲醛固定， 组织进行石蜡包埋， 5 μm 厚连续切片， HE染色进行普通病理组织学观察及肺癌组织的病理学分级； 用兔抗ASB-8多克隆抗体（1∶250稀释）作为第一抗体，
用兔源性EnVision system（HRP）两步法检测试剂盒作为二抗检测试剂， DAB显色， Mayer氏苏木素复染核， 进行免疫组化， 检测该基因在人正常肺、癌旁肺及肺癌组织中的表达差异。

1.2.7       统计学分析    所有数据采用Student’s t-检验进行统计分析。

2    结果(Results)

2.1   重组质粒的酶切及序列鉴定

以pCMV-Script-ASB-8质粒为模板， 分别扩增ASB-8编码区和编码1～235氨基酸区域，
酶切后连接到pcDNA3.1/Myc-His B()真核表达载体上， 得到阳性克隆pASB-8-Myc-His， pASB-8ΔSB-Myc-His， 经酶切鉴定符合正确（图1）。 测序结果显示， 插入序列完全正确。将纯化的ASB-8蛋白进行SDS-PAGE电泳， 通过考马斯亮蓝染色， 得到一约32.5 kD的单一条带， 同时， 利用制备的ASB-8抗体对其进行了检测（图2）。 还对A549、 SPC-A1和NCI-H446肺癌细胞系进行了Western印迹分析， 发现此多抗能检测到与原核表达ASB-8大小一致的条带， 说明该蛋白质在3种肺癌细胞中均有表达（图3）。

Fig.1       Identification
of recombinant plasmids by restrict endonucleases digestion

1,
DL-2000 marker; 2, pASB-8-Myc-His; 3, pASB-8ΔSB-Myc-His; 4, marker λ-DNA / HindIII+EcoRI.2.2ASB-8的多抗制备及Western 印迹检测

Fig.2       SDS-PAGE
and Western blotting of the purified recombinant ASB-8 protein

1, predyed
protein marker; 2, ASB-8 detected by SDS-PAGE; 3, ASB-8 detected by Western
blotting; 4, biotinylated protein ladder.

Fig.3       Western
blotting of ASB-8 protein in human lung cancer cells

1,
A549; 2, SPC-A1; 3, NCI-H446.

2.3   人ASB-8在肺癌细胞系、正常肺、癌旁肺和肺癌组织中的表达

利用制备的ASB-8多克隆抗体进行免疫细胞化学检测， 结果显示， ASB-8蛋白在肺癌组织（腺癌、鳞癌、小细胞肺癌和肺泡癌）中高表达， 阳性率为96.8%（30/31）， 而在癌旁肺和正常肺组织低表达或不表达，
弱阳性率仅为25.8%(8/31)； ASB-8蛋白在SPC-A1中高表达（图4和表1）。

Fig.4       Immunohistochemistry
analysis of ASB-8 in cell line and tissues

（A） SPC-A1 lung
adenocarcinoma cell line (400×). （B） Noncancerous lung tissue (400×). (C) Human lung squamous
cell carcinoma (400×). (D) Human lung adenocarcinoma (400×).

Table 1   Immunohistochemistry analysis of
ASB-8 in lung cancers

Immunohistochemistry analysis is determined according to both the
number and color of positive cells. “－”, no positive cell; “±”, <15%; “+”, 15%－25%;  “++”, 25%－50%;  “+++”, 50%－75%;  “++++”, >75%. Total
positive (%) is calculated according to ≥ “++”.

2.4   ASB-8和突变体ASB-8ΔSB在SPCA-1细胞的外源性表达

分别提取稳定表达ASB-8、ASB-8ΔSB和空载体质粒的SPC-A1细胞系的蛋白质，
SDS-PAGE电泳后， 经Western 印迹， 利用Myc抗体可以检测到转染含Myc标签的ASB-8、ASB-8ΔSB蛋白（图5）。

Fig.5       Immunoblotting
analysis of SPC-A1 cell lines for overexpressing Myc/His tagged ASB-8 and
ASB-8ΔSB

1, SPC-A1 cells transfected
with empty vector; 2, SPC-A1 cells transfected with pASB-8-Myc-His; 3, SPC-A1
cells transfected with pASB-8ΔSB-Myc-His.

2.5   ASB-8及其SOCS盒缺失突变体的表达对肺癌细胞生长的影响

对转染细胞用MTT试验进行生长曲线测定， 从0天起检测第一组数据，
其后每隔24 h检测一次（图6）。 检测数据表明在接种后72 h内， 转染ASB-8、ASB-8ΔSB和空载体的细胞的增殖基本上未见明显差别。
接种后的第4～6天的结果显示， 转染表达ASB-8ΔSB细胞的增殖明显比对照组细胞和转染ASB-8细胞缓慢(P<0.01)。 裸小鼠荷瘤试验显示， 转染ASB-8、ASB-8ΔSB和空载体的细胞在裸小鼠体内成瘤平均的瘤重分别为（0.75±0.22）g，
（0.4±0.07）g和（0.72±0.12）g； ASB-8ΔSB表达组较空载体组的细胞而言，
其在体内形成的肿瘤明显减小（P<0.01）。 这表明高表达缺失SOCS盒的ASB-8突变体对肺癌细胞的生长具有一定的抑制作用。

Fig.6       Effect of
ASB-8 and ASB-8ΔSB on cell proliferation of SPC-A1 lung tumor cell

3    讨论（Discussion）

人ASB-8是我们通过功能筛选从人胎盘cDNA文库获得的一新的全长cDNA片段。 人ASB-8基因定位于染色体12q13； 序列分析表明， ASB-8全长2545 bp,
ASB-8的开放阅读框含864 bp,
编码288个氨基酸。 经过生物信息库的同源比较，
发现该基因编码的蛋白质和小鼠ASB-8在全蛋白质水平上有96%的同源。 ASB-8蛋白的近氨基端含4个锚蛋白重复序列； 分别位于第52～84、85～116、117～149和150～182位氨基酸上； 羧基端有一SOCS 盒， 位于235～288位氨基酸[7]。

ASB-8在结构上属ASB蛋白家族一成员。 该家族的结构特点主要是其近氨基端存在锚蛋白重复序列， 后者的生物学功能是为介导蛋白质之间相互作用提供相应结合部位。
SOCS盒首先被发现在一类能够阻断JAK-STAT通路、抑制细胞因子信号转导的蛋白质家族成员中，
为一保守的、位于蛋白质羧基端的结构域。 目前，
有关SOCS 盒的生物学功能的资料， 主要来源于SOCS-1、 SOCS-3及VHL蛋白的研究。
首先， 这类蛋白质的羧基端SOCS 盒作为一衔接头（adaptor）区域， 而介导它们与延伸蛋白B/C复合体结合； 由于延伸蛋白B的氨基端有一遍在蛋白样功能域（ubiquitin-like domain， UBL）， 可能会与某些蛋白酶体的亚单位结合，
延伸蛋白 C又可偶连剔除蛋白-2(cullin-2)； 所以最终形成延伸蛋白B/C 依赖的E3遍在蛋白连接酶（E3）复合物, 其结果将导致含SOCS 盒的蛋白质的靶向蛋白质的遍在蛋白化与蛋白质水解[8,9]。  目前有关ASB家族的生物学功能的研究较少见； 有报道表明ASB-2基因可被全反式视黄酸诱导上调， 并可抑制髓性白血病细胞的生长[10,11]； 剔除ASB-1基因对小鼠的精子发生有一定的影响[12]。 另外， ASB-8羧基的SOCS 盒并不保守， 第249位至 259氨基酸残基TLKTLARYAV不完全符合保守的(A,P,S,T)LXXX (C,S)XXX(A, I,
L,V)， 其中第6位残基是A而不是保守的C或S；
但我们的研究证实ASB-8可与延伸蛋白B 和延伸蛋白C结合，
而保守位点T、 L的突变可抑制ASB-8与延伸蛋白B/C复合物的结合； 该结果提示ASB-8有可能参与对未知特定靶蛋白质的降解[7]。

肺癌是一种常见的多病因导致的疾病，
其发生和发展经历了一系列遗传学上的变化， 因此发现和研究与肺癌相关的新基因对阐明该类型肿瘤的发生机制具有重要意义。
本研究中， 我们发现ASB-8蛋白在SPC-A1、 A549和NCI-H446肺癌细胞系中均有表达； 对临床肺癌组织的观察结果也表明， 该蛋白质在腺癌、鳞癌、小细胞肺癌和肺泡癌中呈较高水平表达，
总阳性率为96.8%（30/31）；
肺癌组织中ASB-8的表达明显高于癌旁或正常肺癌组织。 ASB-8在肺癌组织中表达上调提示， 该基因可能对肺癌细胞生长有一定的调节作用。
我们以SPC-A1细胞系为研究对象， 观察外源性表达的ASB-8及其突变体对该细胞生长可能的调节作用； 结果表明， 缺少SOCS 盒的ASB-8突变体对肺癌细胞SPC-A1在体外可明显抑制细胞的生长， 而ASB-8的表达对细胞生长状态没有明显影响。 体内实验进一步表明， 该缺失突变体可以显著抑制肿瘤的生长。
我们推测ASB-8ΔSB以显性负调控的效应（dominant negative effects）干扰细胞内ASB-8蛋白的正常生理作用， 从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用； 但其确定的分子机制有待进一步研究；
另外， 如能发现潜在的与ASB-8 锚蛋白重复序列相结合的蛋白质， 并研究其相互作用， 将会进一步帮助我们了解ASB-8的功能。 本研究初步表明， ASB-8可能参与了肺癌细胞的生长调节， 并可能与此疾病的发生和发展有着一定的关系。

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收稿日期：
2003-01-24      接受日期： 2003-03-28

国家重点基础研究发展规划项目(973计划)（No.G1998051209）， 国家高技术研究发展计划 （863计划）资助项目（No.2001AA227121和No.2001AA221141）

*联系人： Tel, 021-64047029-1102; Fax, 021-64177401; e-mail,
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