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https://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN 0582-9879 |
Screening
and Identification of Novel Genes Involved in Biosynthesis of Ginsenoside in Panax
ginseng Plant
LUO Zhi-Yong*, LU Qiu-Heng, LIU Shui-Ping,
CHEN Xiang-Hui, LUO Jian-Qing, TAN Li-Jun, HU Wei-Xin*
( Molecular
Biology Research Centre, Xiangya Medical College, Central South University,
Changsha 410078, China )
Abstract The
root of Panax ginseng plant undergoes a specific developmental process to
become a biosynthesis and accumulation organ for ginsenosides. To identify and
analyze genes involved in the biosynthesis of ginsenoside, suppression
subtractive hybridization (SSH) between mRNAs of 4- and 1-year-old root tissues
was performed, and a subtracted cDNA library specific to 4-year-old roots was
constructed. Forty cDNA clones selected randomly from the subtracted cDNA
library were sequenced. Sequence information of all clones was evaluated by
Nucleotide Blast analysis in GenBank/DDBJ/EMBL. The results showed that six
subtracted cDNA clones represented the novel genes (ESTs), because no sequence
homology with any known sequences was found in the database. Expression in
4-year-old P. ginseng root tissues was verified by reverse Northern dot
hybridization for the six clones. These six novel genes were named GBR1, GBR2,
GBR3, GBR4, GBR5, and GBR6, and their Accession numbers of GenBank are
AF485334, AF485335, AF485336, AF485337, AF485332, and AF485333, respectively.
Finally, Northern blot analysis and semi-quantitative reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR) confirmed that these six novel genes were
differentially expressed in the defined development stage of P. ginseng plant
roots. It is possible that their overexpression may play an important role in
the ginsenoside biosynthesis. In addition, most of transcripts of all genes
could also be detected in other P. ginseng plant tissues such as stem, leaf and
seed. Our results provided a basis for obtaining the full-length cDNA sequences
of such six novel genes, and for identifying their function involved in the
biosynthesis of ginsenoside.
Key words Panax ginseng plant;
ginsenoside biosynthesis； gene screening； suppression subtractive hybridization
Received: February 24, 2003 Accepted:
March 13, 2003
This work was supported by the grants from
the National Natural Science Foundation of China (No. 39800190) the Provincial
Natural Science Foundation of Hunan (No. 02JJY2045), and the Science Fund for
Distinguished Young Scholars of Hunan Medical University (No. 200002)
*Corresponding author: Tel, 86-731-4805449;
Fax, 86-731-4481180; e-mail, [email protected]
or [email protected]
人参植物皂苷生物合成相关新基因的筛选与鉴定
( 中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心， 长沙 410078 )
摘要 人参植物根进行的特定发育过程在药用次生物――人参皂苷生物合成和累积中发挥重要作用。 为从人参根中分离出人参皂苷生物合成相关基因， 采用抑制差减杂交技术，
构建四年和一年生人参根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库。 对从差减文库中筛选的40个阳性cDNA克隆进行酶切、PCR与逆向Northern斑点杂交鉴定、DNA测序以及核苷酸序列同源性比较。 结果表明，
获得的6个差减克隆在GenBank/DDBJ/BMBL无对应的同源基因， 代表新基因序列。 与此同时， 使用Northern印迹杂交验证及半定量RT-PCR进一步确认， 6个转录本为根发育阶段差异性表达基因。 因而提示，
它们可能在人参皂苷生物合成中发挥了重要作用。 此外，
在人参茎、叶与种子中亦能检测到上述基因转录本的表达。 目前， 6个新基因已被命名，在GenBank注册并获登录号， 为克隆上述新基因cDNA全长序列及深入鉴定其在人参皂苷生物合成中的功能提供了重要实验依据。
关键词 人参植物；
人参皂苷生物合成； 基因筛选； 抑制差减杂交
近年来，
药用次生代谢产物生物合成(second-ary metabolite
biosynthesis)基因调控研究已成前沿研究领域。 目前， 开展药用次生物基因调控研究的有红豆杉[1,2]、长春花[3，4]、罂栗[5]、紫草[6]、青蒿[7]、颠茄[8]等药用植物。 药用植物人参Panax ginseng C.A. Meyer为五加科人参属植物，
它的次生代谢产物人参皂苷(ginsenoside)为异戊二烯单元(五碳)构成的四环三萜达玛烷类化合物，
由人参二醇和人参三醇型皂苷组成， 主要分布于根部，
其次为茎和叶。 迄今为止， 分离并确定了结构的皂苷成分有40余种。 各皂苷单体均具有其独特的药理作用，
临床应用十分广泛。 目前由于人参皂苷尚未实现全化学合成，
某些单体皂苷可从根、茎、叶部位提取以满足部分医疗需要， 但对于一些含量甚微、活性较强的单体皂苷如具有强效抗肿瘤活性的Rg3、 Rh2， 以及抗衰老先导化合物Rg1和Rb1等新药开发还较为困难[9～14]。
而应用植物基因工程与组织细胞工程相结合的生物学方法有望成为生产这些低含量的药用次生代谢产物最有效的手段[2,14]。 与其他高等植物的次生代谢产物一样，
属于高等萜类的人参皂苷生物合成途径仍不清楚， 基础研究相对缺乏[14]。 因此，
深入了解人参皂苷生物合成途径(ginsenoside
biosynthetic pathway)及其调控的分子遗传学基础，
从而在分子水平实现皂苷生物合成的人工调控， 将是发展生物技术大量生产人参皂苷的重要前提。
研究表明， 三萜类皂苷(triterpenoid saponins)化合物作为植物次生代谢物中的一类重要组分，
其含量和组成随着植物的遗传背景、组织类型、生长年龄、生理状况以及环境因子的改变而发生显著变化， 而三萜类皂苷含量和组成的变化又取决于三萜类皂苷合酶及其在细胞中的表达水平[14]。 由于人参植物根中皂苷的产生具有生长发育阶段的特异性[9]， 因而提示人参皂苷生物合酶和/或转录调节子基因在生长发育阶段的差异性表达可能在皂苷生物合成中扮演了重要角色。
本研究用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)法[15]分别以源于四年和一年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱动子(driver)， 筛选人参植物中与皂苷生物合成相关的新基因。
1 材料和方法(Materials and
Methods)
1.1 主要试剂与材料
Trizol 试剂购自Invitrogen 公司； mRNA 提取试剂盒PolyATract mRNA isolation
system IV、pGEM-T 载体、AMV 逆转录酶、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、随机引物标记试剂盒及限制性核酸内切酶EcoRI均购自Promega公司； 抑制差减杂交试剂盒PCR-SelectTM cDNA subtractive kit 和Advantage cDNA PCR kit 购自Clontech 公司； PCR产物纯化试剂盒Highpure
PCR product purification kit、质粒提取试剂盒Rapid plasmid miniprep isolation及分子杂交尼龙膜购自Roche公司； 其余试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人参植株年龄鉴定、RNA的分离与mRNA的纯化 林下栽培一年与四年生新鲜人参植株采自吉林省延吉市长白山人参产区， 其遗传背景和环境影响因子一致。 根据人参植株叶子表型鉴定人参年龄[9]。 一年生人参植株：
茎和叶柄无明显界限， 具有三片小叶， 俗称“三花”； 四年生人参植株： 茎顶轮生三枚掌状复叶， 俗称“灯台子”。 分别取四年和一年生新鲜人参根， 经清洗、75 % 乙醇消毒后， 晾干，
用刀片取根部组织， 置盛有液氮的研钵中研磨成细粉，
基于异硫氰酸胍法[16]提取人参根RNA， 并用无RNase的DNase I消化RNA中的痕量DNA。 反应体系中，
每1 μg RNA 内含1 u DNase I， 每 μL反应体积中含1 u RNasin, 37 °C反应1 h， 然后用等体积的苯酚–氯仿、氯仿各抽提1次， 加入3 mol/L NaOAc (pH 5.2)、无水乙醇沉淀， 75%乙醇洗涤2次， 晾干后用无核酸酶的消毒水溶解，
并用紫外分光光度仪测定其浓度。 mRNA的分离与纯化按mRNA 分离试剂盒PolyATract mRNA isolation
system IV(Promega 公司)操作说明书进行。
1.2.2 抑制差减杂交抑制差减杂交 具体操作按 PCR-SelectTM cDNA subtractive
kit(Clontech 公司)说明书进行： 取2 μg mRNA(来自四年生与一年生人参根组织)， 加入1 μL 浓度为10 μmol/L的第一链cDNA合成引物和1 μL AMV逆转录酶(10 u/μL)， 在42 °C空气中培育1.5 h， 逆转录合成第一链cDNA; 使用4.0 μL 20×第二链合成混合酶(6 u/μL DNA聚合酶I、 0.25 u/μL RNase H、1.2 u/μL E. coli DNA连接酶)合成cDNA第二链。 合成的双链cDNA用RsaI酶切， 取经RsaI消化的四年生人参根双链
cDNA作为检测子(tester)， 分为两组， 分别连上接头1与接头2R(接头序列见试剂盒说明)。 以一年生人参根组织的cDNA(不加接头)作为驱动子(driver)， 四年与一年生人参根组织相同的cDNA序列因杂交形成双链被减去， 四年生人参根组织中两端同时带有接头1与接头2R的差异cDNA片段经选择性PC R扩增富集后被克隆。
1.2.3 差减cDNA片段的克隆 将第二次PCR扩增后的正向差减cDNA产物用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提， 加入1/10 体积的3 mol/L
NH4Ac和二倍体积的无水乙醇沉淀， 得到的cDNA片段用10 μL消毒双蒸水溶解。 取50 ng 与pGEM-T载体(Promega)连接,插入片段与载体的摩尔比为3∶1。 取5 μL连接产物转化JM 109感受态受体菌， 涂板后 37 °C培养过夜。 基于蓝–白筛选法， 从LB平板挑取白色阳性克隆菌落接种到含3 mL SOC培养液的10 mL管中， 37 °C培养过夜，
取1 mL菌液按质粒提取试剂盒Rapid plasmid miniprep isolation操作说明书提取外源质粒DNA， 余下菌液加入甘油至终浓度15 %， -70 °C保存。
1.2.4 酶切鉴定 pGEM-T载体上外源插入片段的两端各带有一个EcoRI酶切位点， 对重组质粒进行酶切鉴定： 20 μL反应体系含1 μg重组质粒， 2 μL 10×酶切缓冲液， 5 u EcoRI， 无菌双蒸水补足体系。 37 °C水浴1 h， 65 °C 、10 min终止反应。 取10 μL酶切产物于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳， 鉴定有无外源插入片段， 并估计插入片段的大小。
1.2.5 DNA测序与序列数据分析 挑出的白色阳性菌落经培养扩增后, 以pGEM-T载体上一对通用序列T7/SP6为测序引物， 送上海博亚生物技术有限公司测序,并对测序结果进行两两比较， 排除重复序列。 将得到不重复的目的cDNA序列与GenBank/DDBJ/EMBL数据库进行核苷酸同源性比较(Nucleotide-Blast)分析， 以出现的评分(Score)值<100为没有显著性同源的标准， 代表新的cDNA序列。
1.2.6 新的外源插入片段差减cDNA克隆的PCR鉴定 用一对通用引物T7/SP6扩增pGEM-T载体上的外源插入片段。 50 μL PCR反应体系： 5 μL 10×PCR反应缓冲液、 1.5 μmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 1 μL模板重组质粒菌液、 0.1 μmol/L T7/SP6引物、 3 u Taq DNA聚合酶， 石蜡油覆盖。 PCR反应条件为： 94 °C变性3 min； 再以94 °C变性30 s， 56 °C退火30 s， 72 °C 延伸1 min， 35次循环； 72 °C延伸10 min。 取5 μL PCR产物于1.5 % 琼脂糖凝胶中电泳， 溴乙锭染色， 紫外灯下照相， 鉴定有无插入片段， 并估计插入片段的大小范围。
1.2.7 Northern印迹杂交 (1) 探针制备采取随机引物法用[α-32P]dCTP标记探针。 以T7/SP6引物PCR扩增6个差减cDNA克隆的外源插入片段， PCR产物的凝胶电泳条带经柱层析纯化、回收后， 置沸水变性10 min， 迅速冰浴。
在冰上加入以下试剂： 10 μL模板DNA(约50 ng)、 2 μL 6核苷酸随机引物(600
ng)、 2 μL dNTPs(终浓度各为0.1 mmol/L， 无dCTP)、 1 μL Klenow酶(2 u)、 5 μL [α-32P]dCTP (共16.7 mol)， 混匀， 37 °C温育1 h，
乙醇沉淀， 备用。
(2) Northern印迹杂交取30 μg总RNA进行1％的甲醛变性凝胶电泳， 转印尼龙膜， 膜在 80 °C烘干2 h， 加入6×SSC、5×Denhardt’s、5 g/L SDS和100 mg/L的鲑精DNA, 68 °C预杂交1 h， 加入变性探针， 68 °C杂交过夜； 以含5 g/L SDS 的2×SSC室温下洗膜2次，
再用含5 g/L SDS 的0.5×SSC 50 °C洗膜2次， 杂交膜置室温干燥后， 经32P显像系统显示杂交条带。
1.2.8 半定量RT-PCR (1) PCR引物设计与合成根据引物设计原则设计GBR1～GBR6 cDNA序列中特异引物， 并由上海博亚生物技术公司合成。
GBR1(145 bp): S(有义引物) 5′ACCGATGGATGATGGGATACCA
3′, AS (反义引物) 5′ACCTAAGACATGAGCAAAATCCA 3′; GBR2(169 bp): S 5′ACACCCAATTACGACTAAGA 3′, AS 5′TGGAACTAATTGTGCGTGCA 3′; GBR3(259 bp): S 5′TCTAGTCTATGATATATAGTATGGA 3′, AS 5′TAACACAAATAGCACTCCTTACA 3′; GBR4(399 bp): S 5′ACGTATAGGTA GCTAGCATAACA 3′, AS 5′GTTGAATTAAGAGAGTTTGGTTCA 3′; GBR5(351 bp): S 5′TCTGATTAGTTCAGGGTCG 3′, AS 5′ACATGCATGCATCGTCAGAT 3′; GBR6(400 bp): S 5′ACCGCATGCATGGTGATATCT 3′, AS 5′ACGAGGACTCATAATTTTCGCAT 3′; GAPDH(626 bp): S 5′GCTCACTTGAAGGGTGG 3′, AS 5′CCATTCGTTGTCGTACCA 3′。
(2) 半定量RT-PCR取RNA约2 μg， 逆转录(RT)反应按RT试剂盒(Promega公司)操作步骤进行。
50 μL PCR反应体系中含5 μL 10×PCR反应缓冲液、1.5
mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTP、 5 μL模板cDNA、0.1 μmol/L特异引物、3 u Taq
DNA聚合酶， 石蜡油覆盖。
为较客观地反映mRNA表达的相对水平， 在靶基因及内对照GAPDH的PCR产物进入平台期前结束PCR， 根据PCR指数增长曲线， 选择产量高而又位于平台期前的循环次数。
优化的PCR反应条件为： 94 °C变性3 min； 再以 94 °C变性30 s， GBR1～GBR6和GAPDH特异引物的退火温度分别为60 °C、54 °C、58 °C、60 °C、54 °C、60 °C、52 °C复性30 s， 72 °C延伸30 s； GBR1～GBR6和GAPDH的循环次数亦分别为23、35、33、33、35、33、33, 72 °C延伸10 min。 取10 μL于1.5 % 琼脂糖凝胶中电泳， 溴乙锭染色后， 紫外灯下照相， 并经Eagle Eye Ⅱ图像识别分析系统(Stratagene公司)进行电泳条带光密度扫描， 以光密度积分值比值GBRn/GAPDH代表GBRn(n＝1,…,6) mRNA的表达水平， 实验重复3次，
数据使用SPSS软件包处理， 统计学方法采用配对的t检验。
2 结果(Results)
2.1 人参植物根组织RNA分离和mRNA的纯化
采用异硫氰酸胍法[16]分别从一年和四年人参根组织提取总RNA， RNA电泳结果[图1(A)]显示， 可见28 S、 18 S、 5 S rRNA三条明显的区带， 表明获得RNA完整性较好； 紫外分光光度法测得的A260/A280介于1.8～2.0， 亦表明RNA有较高的纯度。 上述总RNA经mRNA纯化试剂盒分离， 分别得到约2 μg的mRNA；
取2 μL电泳， 结果显示[图1(B)]， 获得的mRNA的质和量能够满足差减cDNA文库构建的要求。
Fig.1Total
RNA isolated from P. ginseng plant roots and mRNA purified from the total
RNA were electrophoresed on a 1%
agrose gel, respectively
(A) and (B), stands for total
RNA and mRNA derived from P. ginseng plant roots，respectively. 1, 1-year-old
root tissues; 2, 4-year-old root tissues
2.2 差减cDNA文库的构建及阳性克隆筛选
应用SSH技术， 以四年生人参根为检测子，
一年生人参根为驱动子， 进行正向差减杂交， 经两次差减杂交和两轮抑制性PCR扩增， 对第二次PCR扩增产物进行差减效率分析。 结果显示， 抑制差减杂交有效富集了四年生人参根组织差异表达的cDNA片段， 即差减的与未差减的四年生人参根cDNA群体比较， 差减群体中出现了未差减群体中没有的电泳条带，
表明低丰度差异表达片段得到了富集； 与此同时，
原来存在于未差减群体中的条带在差减群体中缺失， 表明同源片段被有效地差减(图2)。差减得到的cDNA群体用T/A克隆法构建质粒载体文库。
经蓝–白筛选，
随机挑出40个阳性克隆菌落，
提取阳性扩增菌质粒DNA， 根据pGEM-T载体外源插入片段两侧的EcoRI位点进行酶切鉴定分析， 电泳结果显示， 87.5%的阳性克隆存在插入子， 且片段大小介于200～1000 bp不等(图3)。
Fig.2 Analysis of
subtractive efficiency
M,
100 bp DNA ladder; 1, secondary PCR products of subtracted 4-year-old ginseng
root cDNA population; 2, secondary PCR products of unsubtracted 4-year-old
ginseng root cDNA population.
Fig.3 Restriction
analysis of JM109 clones containing recombinants
M, 100 bp DNA ladder plus; 1－40, stands for
single clone plasmid digested with EcoRI, respectively.
2.3 cDNA单向测序与序列分析
为进一步获取片段的序列信息，
对40个阳性cDNA克隆进行单序列测序并与GenBank/DDBJ/EMBL数据库进行核苷酸同源性比较。 结果显示，
筛选获得的6个差减cDNA克隆为人参植物中首次克隆， 代表新基因序列， 它们的cDNA序列长度分别为145 bp、227 bp、291 bp、400 bp、421 bp和1049bp； 此外， 13个系非差减克隆即背景克隆(序列信息未列出)； 另有21个为重复拷贝克隆。
2.4 差减cDNA克隆的PCR鉴定
用pGEM-T载体T7/SP6引物序列， 选择对6个差减cDNA克隆进行PCR鉴定， 结果显示， PCR产物大小介于300 bp～1500 bp之间， 其中包含pGEM-T 载体上T7/SP6引物序列、限制酶识别序列和接头2部分序列共219 bp。 因此， PCR扩增6个差减克隆插入子大小与其测序结果相符(图4)。
同时， 反向Northern斑点杂交试验进一步显示， 6个差减cDNA克隆杂交均呈阳性(结果未列出)。
Fig.4 Identification
of foreign inserted fragments by PCR using T7/SP6 primers of pGEM-T vector
M, 100 bp DNA
ladder plus; 1－6, PCR products of GBR1－GBR6.
目前，
上述6个差异表达新基因cDNA序列已被命名， 获GenBank 登录号。 它们分别是： GBR1(AF485334)： 145 bp、GBR2(AF485335)： 227 bp、GBR3(AF485336)： 291 bp、GBR4(AF485337)： 400 bp、GBR5(AF485332)： 421 bp和GBR6(AF 485333)： 1049 bp。
2.5 cDNA序列在植物人参多组织中的表达分析
为验证GBR1～GBR6在人参植物根组织中是否为根发育阶段差异表达新基因，采用Northern印迹杂交技术， 比较分析了以上各转录本在四年和一年生人参根中的表达水平。
结果显示(图5)， 与一年生人参相比，
在四年生人参根组织中， 各转录本均为表达增强的基因，
且初步确定GBR1、GBR2、GBR3、GBR4、GBR5和GBR6转录本全长分子大小分别为1
kb、1.3 kb、1.3 kb、1.6 kb、1.35 kb、3 kb。
Fig.5 Northern
blot hybridization analyses of GBR1,GBR2,GBR3,GBR3,GBR4,GBR5, and GBR6
expression in root tissues of P. ginseng
1,
1-year-old roots; 2, 4-year-old roots.
此外，
应用半定量RT-PCR法进一步确认了各转录本在四年和一年生人参植物根、茎、叶及种子中的表达。 结果显示(图6)， 与一年生人参相比，
上述转录本在四年生人参根组织中均表达增强(P<0.01)， 与Northern印迹杂交结果一致。 此外,在人参茎、叶与种子中能检测到上述基因多数转录本的表达(数据未列出)。
Fig.6 Expression
of GBR1,GBR2,GBR3,GBR4,GBR5 and GBR6 transcripts in root tissues of P. ginseng
plant shown by semi-quantitative RT-PCR
The resulting PCR products were
separated by agarose gel electrophoresis, and the GBRn/GAPDH ratio of the
density of EtBr-stained bands represented the expression level of GBRn
transcript (n=1,…,6). The values shown are 
± s
determined from three independent RT-PCR experiments.
3 讨论(Discussion)
近年来药用植物有效成分生物合成基因调控研究进展迅速，
抗肿瘤药物紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春花碱(vinblastine)； 抗菌药紫草宁(shikonin)； 抗疟疾药青蒿素(artimisinin)以及镇痛药吗啡(morphine)等药用次生代谢产物生物合酶部分相关基因相继被克隆， 为采用基因工程化细胞生产以上药用次生物提供了可能[1～7]。
目前有关提高生物合成人参皂苷含量的研究，
主要仅局限于优化组织细胞培养条件， 寻找提高培养细胞皂苷产量的物理、化学诱导子(elicitor) [17]， 以及利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中Ri质粒上的T-DNA区整合到人参细胞核基因组内， 从而建立生产人参皂苷的发根培养细胞系方面[18]。 但因人参悬浮培养细胞属于未分化细胞，
不利于皂苷的生物合成。 人参毛根虽具有部分器官的性质，
亦难以从根本上解决皂苷合成量低的难题。 所以要实现提高人参皂苷生物合成的产量，
最终有赖于在其生物合成关键酶及其转录调节子基因克隆、结构及其表达调控研究上取得进展。
人参植物皂苷属于三萜类皂苷化合物。
许多不同植物在它们正常生长、发育过程中伴随着三萜类皂苷生物合成， 特别是这类化合物的所具有的药用特性、抗微生物活性以及在植物疾病抗性中可能发挥的决定性作用吸引了人们对其进行研究的兴趣。
新近研究表明[14]， 三萜类皂苷经由异戊二烯途径(isoprenoid pathway)通过第一个限速步骤――2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-oxidosqualene
cyclases， OSCs)作用(该酶为一超家族三萜类环化酶)， 从而使2,3-氧化鲨烯环化形成齐墩果烷或达玛烷三萜类骨架， 然后三萜类骨架经细胞色素P450依赖性单加氧酶、糖基转移酶及其他酶类介导进行如氧化、置换及糖基化等化学修饰， 形成许多不同的三萜类皂苷终产物。 由于目前对三萜类皂苷生物合酶及其生化途径仍了解甚少，
因而只有详尽阐明皂苷生物合成途径分子基础， 才有可能经由单个或多个酶促步骤的遗传工程改良，
实现人工调控三萜类皂苷次生代谢物在植物或植物细胞中的生产。
另一方面，
植物中许多控制主要发育性状和代谢性状的转录因子， 在调控植物初级和次级代谢途径中亦起着重要作用，
这种扮演主导调节子(master regulator)作用的单个转录因子能够以协调的方式控制涉及大量生物合酶基因表达的复杂次生代谢通路 [3，4，19，20]。 例如，
苯丙烷类和类黄酮(phenylpropanoid and
flavonoid)生物合酶结构基因的组织特异性表达均受控于两个独特的转录因子――MYB 和bHLH蛋白[19，20]。 此外， van der Fits等[4]运用T-DNA标签法从药用植物长春花(Catharanthus roseus)悬浮培养细胞中， 分离出属于二萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids， TIAs)的该植物次生物(长春新碱和长春花碱)生物合成途径的主导调节子基因Orca3， 该基因编码产物ORCA3含有一个AP2/ERF功能域,为茉莉酮应答性调节子(jasmonate-responsive regulator)[3]。
迄今已证明， 利用这些主导调节子人工调控苯丙烷类和类黄酮以及TIAs生物合成是可能的。
目前，
由于三萜类皂苷分子本身的复杂性， 以及尚缺乏其生化途径研究的代谢中间体[14]， 因此采用分离和鉴定三萜类皂苷生物合酶的经典遗传学策略难以取得进展。
有鉴于此， 我们首先应用反向遗传学策略，
从克隆人参植物皂苷生物合酶及其转录调节子基因方面寻找突破点。
本研究的基础是根据人参植物在同一遗传背景、组织类型、生理状况，
以及环境影响因子所表现出的不同生长年龄皂苷生物合成的特性： 即，
一年生人参根人参皂苷含量极微， 第四年急剧增加；
以后随着年龄的增加人参皂苷含量变化不大[9，14]。
以四年生人参根组织作为切入点， 应用SSH法[15]， 通过比较四年和一年生人参根组织基因表达谱，
经两轮分子杂交和抑制性PCR扩增后， 直接亚克隆入pGEM-T载体， 构建了四年生人参根特定的差减cDNA文库； 进行阳性克隆筛选，
酶切鉴定、DNA测序、GenBank/DDBJ/BMBL数据库同源性比较分析。 结果表明， 筛选获得的6个差减cDNA克隆在GenBank/DDBJ/BMBL无对应的同源基因， 系人参植物中首次克隆， 代表新基因序列(EST)。
与此同时，
我们应用Northern印迹杂交验证和半定量RT-PCR法进一步确认， 与一年生人参相比， 以上6个新基因转录本均系四年生人参根组织表达增强的基因。
因而提示， 它们可能在人参皂苷生物合成中发挥着重要作用。
此外,在人参茎、叶与种子中亦检测到上述大多数基因转录本的表达。
目前， 这6个新基因已被命名， 获GenBank登录号。 它们分别是： GBR1(AF485334)、 GBR2(AF485335)、 GBR3(AF485336)、 GBR4(AF 485337)、 GBR5(AF485332)、 GBR6(AF485333)。 此外， 使用Northern印迹杂交分析， 已初步确认上述转录本对应的全长cDNA分子大小分别为1 kb、 1.3 kb、 1.3 kb、 1.6 kb、 1.35 kb、 3 kb。
迄今， 这6个新基因的结构和功能仍在深入研究之中。
综上所述，
本研究应用SSH技术成功地从四年生人参植物根中分离与鉴定出6个根发育阶段差异表达新基因序列， 为我们下一步克隆它们的cDNA全长以及深入鉴定其在人参皂苷生物合成中的功能提供了重要的实验依据。
致谢：延边大学医学院附属医院朴松旭老师在人参样本采集中所给予的大力支持和帮助。
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收稿日期：
2003-02-24 接受日期： 2003-03-13
国家自然科学基金资助项目(No.39800190)、湖南省自然科学基金资助项目(No.02JJY2045)及湖南医科大学杰出青年科学基金资助项目(No.200002)
*联系人： Tel, 0731-4805449; Fax, 0731-4481180; e-mail, [email protected]
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