Effect
of Calpain on the Degradation of tau Protein in Rat Brain Cortex Extracts
FANG Zheng-Yu, LIU Shi-Jie,
WANG Xiao-Chuan， LIU Rong， WANG Qun， CHEN Zheng-Yue， WANG Jian-Zhi*
( Neuroscience Institute， Pathophysiology Department， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030，
China )
Abstract Calpain
is a calcium-activated protease and has two ubiquitously distributed mammalian
isoforms, namely calpain 1 (calpain I, μ-calpain and CAPN1) and calpain 2
(calpain II, m-calpain and CAPN2). Calpains regulate the function of many
proteins by limited proteolysis. To determine the nature of different subtypes
of calpain on degradation of microtubule-associated protein tau, the rat cortex
extracts were incubated with 0.2 mmol/L, 1 mmol/L, 3 mmol/L and 5 mmol/L of
CaCl2 for 15 min at 37 ℃, respectively, and it was found that Ca2+
treatment at concentrations 1－5 mmol/L led to significant proteolysis of the tau protein and this
degradation was blocked by calpain inhibitor, calpeptin. In addition, when the
extracts containing 1 mmol/L CaCl2 were treated with μ-calpain inhibitor (0.05
μmol/L of calpastatin) or m-calpain inhibitor (100 μmol/L calpain inhibitor IV)
or both, the Ca2+-induced degradation of tau protein was blocked to
about 8.6%， 92.5% and
97.8% compared with the group with 1 mmol/L CaCl2, respectively. These data
suggest that both μ-calpain and m-calpain in brain cortex extracts are
activated by Ca2+ and both of them degraded tau protein, although,
m-calpain plays a more important role in proteolysis of the tau protein.
Key words calpain; tau protein;
calcium; Alzheimer disease
_________________________________________
Received: March 31, 2003 Accepted: May 7, 2003
This work was supported by the grants from
the National Natural Science Foundation of China (No. 39925012, No. 39970808,
No. 30100213)
*Corresponding author： Tel， 86-27-83692625； Fax，
86-27-83693883； e-mail， [email protected]
钙蛋白酶对鼠脑皮质中细胞骨架蛋白
tau的降解作用
方征宇 刘世杰 王小川 刘蓉 王群 陈正跃 王建枝*
( 华中科技大学同济医学院病理生理学系，神经科学研究所， 武汉
430030 )
摘要 钙蛋白酶(calpain)是钙依赖性中性蛋白酶， 根据其对钙敏感性的不同， 可分为m-和μ-钙蛋白酶两型。 分别用不同浓度CaCl2溶液温育Wistar大鼠脑皮质匀浆液， 并用Western印迹和定量图像分析技术检测不同亚型钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用。 发现：在37 ℃用1 mmol/L Ca2+温育底物15 min， 即出现大量分子量为29 kD的tau蛋白降解片段； 当Ca2+浓度为5 mmol/L时， tau蛋白几乎全部被降解； 这种tau蛋白降解可被特异性的钙蛋白酶抑制剂完全逆转。
进一步的研究发现， 分别用μ-钙蛋白酶抑制剂（0.05
μmol/L calpastatin）， m-钙蛋白酶抑制剂（100
μmol/L calpain inhibitor IV）或总钙蛋白酶抑制剂（552 μmol/L calpeptin）与1 mmol/L Ca2+共同温育Wistar大鼠脑皮质匀浆液， 1
mmol/L Ca2+激活的tau蛋白降解分别被抑制8.6%、 92.5%和97.8%。
该研究结果表明， 一定浓度的Ca2+可同时激活μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶， 这两种亚型均参与降解tau蛋白， 但m-钙蛋白酶的作用比μ-钙蛋白酶更强。
关键词 钙蛋白酶； tau蛋白； 钙离子； 阿尔茨海默病
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease, AD)是一种典型的神经退行性疾病，
其主要临床表现为进行性加重的记忆力减退和认知功能低下， 发病率随年龄增长而显著上升。
AD两大特征性病理改变为：神经元外的老年斑(senile plaque, SP)和神经元内的神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）。 NFTs由成对螺旋细丝（paired
helical filaments， PHF）构成， 而成对螺旋细丝的主要成分是过度磷酸化的tau蛋白［1～4］。
过度磷酸化的tau蛋白也可和正常tau蛋白结合成螺旋细丝。 虽然NFTs的形成机制在很大程度上还不清楚， 但是蛋白水解酶系统功能障碍可能在神经原纤维退化过程中起重要作用。
钙蛋白酶(calpain)是钙依赖性中性蛋白酶， 其活性中心富含半胱氨酸。 最早于1964年由Guroff［5］从大鼠脑组织匀浆液中提取。
随后， Yoshimura等［6］从大鼠肾脏纯化出对钙敏感性不同的两种钙蛋白酶亚型，
即钙蛋白酶1 (μ-钙蛋白酶, CANP1)和钙蛋白酶2(m-钙蛋白酶, CANP2)。 钙蛋白酶参与细胞增殖、 分化和凋亡等基本细胞事件［7，8］。
体外实验发现tau蛋白是其特异性底物， 激活的钙蛋白酶可降解PC12细胞中的tau蛋白［9］。
然而， 目前对不同亚型钙蛋白酶对tau蛋白的作用尚无报道， 而阐明这一问题对设计相应策略激活特定亚型钙蛋白酶， 防止或阻断AD样tau蛋白聚积有指导意义。
本文用CaCl2溶液在37 ℃温育大鼠脑皮质匀浆液， 以此激活钙蛋白酶， 或同时采用μ-型和m-型钙蛋白酶抑制剂，
研究钙蛋白酶及其亚型对tau蛋白的降解作用。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1.1 材料
1.1.1 动物 健康雄性清洁级Wistar大鼠， 体重180～250 g， 购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。
1.1.2试剂与仪器 μ-钙蛋白酶抑制剂（calpastatin）、 m-钙蛋白酶抑制剂（钙蛋白酶抑制剂IV）、 总钙蛋白酶抑制剂（calpeptin）购自CalBiochem公司； 无水氯化钙（分析纯）购自广东西陇化工厂； 40%聚丙烯酰胺， 四甲基乙二胺（TEMED）， 三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Sigma公司； 过硫酸铵和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid， BCA）购自Pierce公司； 一抗为tau Ab-2购自NeoMarkers公司， 二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。 酶标仪购自Pharmacia Biotech公司； 垂直型电泳槽和湿式电转膜槽购自Hoefer Scientific
Instruments公司； DY-C电泳仪购自东方特立科贸中心； 转膜仪购自Bio-Rad； 图像分析系统-Image pro-plus kodak购自Kodak公司。
1.2方法
1.2.1 取材 大鼠腹腔注射0.03 g/mL水合氯醛（每100 g 注射1 mL）, 麻醉后将其颈椎脱臼断头处死，
迅速取出脑组织， 置于冰浴快速分离双侧大脑皮质，
并制备成25%匀浆液［20 mmol/L Tris・HCl (pH 7.2)、 0.5% NP-40、 150 mmol/L NaCl、 2 mmol/L MgCl2、 10 mmol/L NaF、 1 mmol/L Na3VO4・12H2O、 1 mmol/L EGTA、 1 mmol/L PMSF、 5 mg/L抑蛋白酶肽、2 mg/L抑胃酶肽］， 4 ℃ 10 000 g离心15 min， 取上清备用［10～12］。
1.2.2 量效和时效关系的检测
（1）钙与tau蛋白降解间的量效关系分别用0.2 mmol/L、 1 mmol/L、 3 mmol/L和5 mmol/L CaCl2溶液在37 ℃温育Wistar大鼠脑皮质匀浆液上清液15 min， 然后加入10 mmol/L EGTA， SDS上样缓冲液， 加热煮沸5 min终止反应。 2）钙与tau蛋白降解间的时效关系用1 mmol/L CaCl2溶液在37 ℃分别温育脑皮质匀浆液上清液0
min、5 min、10 min、15 min和30 min， 然后终止反应。
（3）钙蛋白酶抑制剂与tau降解间的量效关系分别将0.01 μmol/L、 0.05 μmol/L、 0.25 μmol/L μ-钙蛋白酶抑制蛋白； 20 μmol/L、 100 μmol/L、 500 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV（m-钙蛋白酶抑制剂）； 276 μmol/L、 552 μmol/L、 1104 μmol/L calpeptin（总钙蛋白酶抑制剂）与含1 mmol/L CaCl2的脑皮质匀浆液上清液37 ℃温育15 min， 然后终止反应（根据产品说明以及实验中所做的量效曲线来选择试剂浓度［13～15］）。
1.2.3 μ-和m-钙蛋白酶对tau的降解作用 分别用1 mmol/L CaCl2， 1 mmol/L CaCl2+0.05 μmol/L μ-钙蛋白酶抑制蛋白， 1 mmol/L CaCl2 +100 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV， 1 mmol/L
CaCl2 +0.05 μmol/L μ-钙蛋白酶抑制蛋白+100 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV， 1 mmol/L
CaCl2+552 μmol/L总钙蛋白酶抑制剂(calpeptin)
37 ℃温育脑皮质匀浆液上清液15
min后终止反应。
1.2.4 Western印迹［16, 17］BCA法检测样品蛋白质浓度后， 在样品中加入10% β-巯基乙醇， 置水浴煮沸3～5 min， 然后将样品加入10%SDS-PAGE， 每孔上样30 μg， 恒流（10 mA/胶）电泳约30 min后改为恒压（100 V）约60 min［电泳缓冲液为：50 mmol/L Tris・HCl (pH 8.3)， 250 mmol/L甘氨酸； 0.1% SDS］。 电泳结束后， 将蛋白质从凝胶转移至NC膜（Pharmacia公司）， 转移电压为100 V（≈270 mA）， 转移时间为1 h［电转移缓冲液为：25
mmol/L Tris・HCl (pH 8.3)、 193 mmol/L甘氨酸、 10%甲醇］。 膜在封闭液（3% BSA、 5% 脱脂牛奶粉溶于TBS）中室温封闭过夜。 将一抗tau Ab-2（1∶200）与NC膜在37 ℃温育2 h， 与碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG 37 ℃温育1 h， 用5-溴-4-氯-3吲哚磷酸一对氨基甲苯盐(BCIP 30 g/L)和对硝基蓝四唑氯(NBT 15 g/L)避光显色。
1.2.5 图像分析及统计分析 采用Kodak图像分析系统及Image-Proplus软件处理Western印迹结果。 使用SPSS 11.0统计软件作单因素方差分析。
2 结果 (Results)
2.1 CaCl2温育脑皮质匀浆液导致tau蛋白降解
分别用0.2 mmol/L、 1 mmol/L、 3 mmol/L和5 mmol/L CaCl2溶液在37 ℃温育脑皮质匀浆液上清液15
min。 结果显示：当CaCl2浓度为1 mmol/L、 3 mmol/L和5 mmol/L时， 在29 kD处出现明显的小分子降解片段；
而对照组和0.2 mmol/L CaCl2组不出现该条带（图1）。 提示1～5 mmol/L
CaCl2可能激活Ca2+依赖的蛋白水解酶， 导致tau蛋白降解。
Fig.1 Concentration dependent tau degradation induced by Ca2+
(A)The rat brain extract was centrifuged
at 10 000 g for 15 min, and the supernatant was incubated with CaCl2 for 15 min
at indicated concentrations. Then the supernatant was examined by Western
blotting with tau Ab-2. (B) Relative levels of total tau and tau fragments in
the supernatant stimulated with CaCl2 for indicated concentration were
quantified by densitometry. The data represent the ±s of nine independent
experiments.
1 mmol/L Ca2+引起tau蛋白降解的时间效应关系的研究表明：在10 min时tau 降解率约为72%； 15 min时约为93%； 30 min时tau几乎全部被降解（以0 min
无钙组总tau含量为1）(图2)。 提示1 mmol/L Ca2+所启动的tau蛋白降解呈明显的时间依赖性， 且该过程在30 min内基本完成。
Fig.2 Time course of 1 mmol/L Ca2+-induced tau degradation
(A) The rat brain extract was
centrifuged at 10 000 g for 15 min, and the supernatant was incubated with 1
mmol/L CaCl2 for indicated times. Then the supernatant was examined by Western
blotting with tau Ab-2. (B) Relative levels of total tau in the supernatant
stimulated with 1 mmol/L CaCl2 for indicated times were quantified by
densitometry. The data represent the ±s of nine independent experiments.
*P<0.01 vs. control at the same time.
2.2 Ca2+激活钙蛋白酶导致 tau蛋白降解
钙蛋白酶是需钙中性蛋白水解酶。
为探讨钙蛋白酶在该体系中对tau蛋白的降解作用， 在上述含1 mmol/L Ca2+培养液中加入不同浓度总钙蛋白酶抑制剂，
结果显示： 当总钙蛋白酶抑制剂浓度为552 μmol/L时， Ca2+诱导的tau蛋白降解率约为2.8%（以1 mmol/L Ca2+组的tau蛋白降解率作为100%）， 将总钙蛋白酶抑制剂浓度提高至1104 μmol/L时， 抑制作用无增强， 当抑制剂浓度为276 μmol/L时， 未见明显抑制作用［图3(B)-4］。 提示Ca2+可能通过激活钙蛋白酶而降解tau蛋白， 且Ca2+激活的钙蛋白酶可被552 μmol/L总钙蛋白酶抑制剂完全抑制。
Fig.3 Concentration dependent inhibition of tau degradation by calpastatin,
calpain inhibitor IV and calpeptin on the level of total tau
(A) The supernatant with 1 mmol/L CaCl2 was incubated with calpastatin,
calpain inhibitor IV or calpeptin at the indicated concentrations for 15 min.
Then the supernatant was examined by Western blotting with tau Ab-2. (B)
Relative levels of total tau protein in the supernatant were quantified by
densitometry. The data represent the x±s of nine independent
experiments.
2.3 激活的μ-钙蛋白酶、 m-钙蛋白酶均可降解tau蛋白
根据钙蛋白酶对钙的敏感性不同，
可将其分为两种亚型： μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶， 它们分别可被10 μmol/L和1 mmol/L Ca2+完全激活［6］。 为探讨这两种亚型钙蛋白酶在tau蛋白的降解中的作用， 本文用不同浓度的钙蛋白酶抑制蛋白（μ-钙蛋白酶抑制剂）、 钙蛋白酶抑制剂IV （m-钙蛋白酶抑制剂）分别与1 mmol/L Ca2+在37 ℃温育Wistar大鼠脑皮质匀浆液15 min。 结果发现：0.05 μmol/L钙蛋白酶抑制蛋白和100 μmol/L 钙蛋白酶抑制剂IV可分别部分或完全抑制Ca2+诱导的tau蛋白降解作用；
提高钙蛋白酶抑制蛋白的浓度至0.25 μmol/L或钙蛋白酶抑制剂IV浓度至500 μmol/L不增加抑制效率； 而0.01 μmol/L钙蛋白酶抑制蛋白或20 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV对Ca2+诱导的tau蛋白降解不起抑制作用［图3(B)-2、(B)-3］， 提示μ-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶均参与Ca2+诱导的tau蛋白降解。
进一步的研究证明：用0.05 μmol/L钙蛋白酶抑制蛋白抑制μ-钙蛋白酶时， Ca2+诱导的tau蛋白降解作用从93%下降至85%； 用100 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV抑制m-钙蛋白酶， Ca2+诱导的tau蛋白降解作用从93%下降至7%； 若将0.05 μmol/L钙蛋白酶抑制蛋白和100 μmol/L钙蛋白酶抑制剂IV合用时， Ca2+诱导的tau蛋白降解作用从93%下降至5%（图4）。
若以1 mmol/L Ca2+诱导的tau蛋白降解率为100%， 则μ-钙蛋白酶对tau的降解作用约为8.6%， 而m-钙蛋白酶对tau的降解作用约为92.5%（图5）。
可见， 本研究体系中m-钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用远比μ-钙蛋白酶强（P<0.01）， 其效率比约为10∶1。
Fig.4
Effect of m- and μ-calpain on the degradation of tauprotein
(A) The supernatant with 1 mmol/L CaCl2 was incubated with
0.05 μmol/L calpastatin, 100 μmol/L calpain inhibitor IV or 0.05 μmol/L
calpastatin +100 μmol/L calpain inhibitor IV for 15 min. Then the supernatant
was examined by Western blotting with tau Ab-2. (B) Relative levels of total
tau in the supernatant were quantified by densitometry. The data represent the
±s of nine independent experiments. *P<0.01 vs. control.
Fig.5 Rate of m- and μ-calpain on the degradation of tau protein
When the rate of Ca2+-induced
tau degradation was set at 100%, the μ-type accounted for 8.6% whereas the
m-type shared 92.5%, demonstrating that m-type calpain is a major tau protease
in the system.
3 讨论(Discussion)
AD患者特征性脑病理改变之一是神经细胞中大量异常修饰的tau蛋白聚积。 考虑到tau蛋白的聚积可能与蛋白水解酶异常有关， 我们在本研究中探讨了不同亚型钙依赖性中性蛋白酶―钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用。 结果发现： 1 mmol/L CaCl2溶液温育大鼠脑皮质匀浆液15 min， 可激活μ-和m-钙蛋白酶， 被激活的两种钙蛋白酶均可降解细胞骨架蛋白tau， 但m-钙蛋白酶的作用比μ-钙蛋白酶约强10倍。 这一研究结果提示： 钙蛋白酶可能藉对tau蛋白的降解作用参与AD患者的神经细胞退化过程。
钙蛋白酶可参与AD样tau蛋白的过度磷酸化和/或异常降解［18～20］。
目前对钙蛋白酶与tau蛋白过度磷酸化之间的关系看法不一。 多数学者认同：活化的钙蛋白酶降解p35成为p25， p25可持续激活CDK-5， 进而导致tau蛋白的过度磷酸化［21～24］；
但也有人认为p35降解不导致tau蛋白过度磷酸化［25］。 钙蛋白酶作为蛋白水解酶， 其更主要的功能是降解靶蛋白， 特别是细胞骨架蛋白。
最近， Adamec等［26］发现50%～75% AD患者的tau神经原纤维病理性改变中存在m-钙蛋白酶的活性形式；
Saito等［27］也报道AD患者μ-钙蛋白酶处于激活状态。 这些资料提示在AD患者退化的神经元中钙蛋白酶处于激活状态。 然而，
激活的钙蛋白酶为何不加速tau蛋白的降解而容许其大量沉淀呢？根据现有的资料， 我们认为下述机制可用来解释这一自相矛盾的现象：在AD早期， 神经元内处于钙缺陷状态，
钙蛋白酶的活性受到抑制［28］， 因而不能有效降解tau蛋白， 这样就增加了失衡的蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶系统的底物， 从而导致过度磷酸化的tau蛋白增多； 而在AD晚期， 即使神经元内的钙浓度升高，
钙蛋白酶代偿性被激活， 但激活的钙蛋白酶仍不能有效降解过度磷酸化的tau蛋白［29， 30］，
结果是过度磷酸化的tau蛋白与正常tau蛋白结合、 堆积， 最后导致神经原纤维缠结的形成。
总之，
本研究首次在脑匀浆系统建立了Ca2+依赖性tau蛋白降解模型，
并首次显示μ-和m-钙蛋白酶均可降解tau蛋白， 且m-钙蛋白酶对tau的降解效率远比μ-钙蛋白酶强。 进一步在细胞和整体水平验证该研究结果，
并探讨钙蛋白酶对过度磷酸化tau蛋白降解作用及其动力学， 对验证和完善上述假说， 阐明蛋白水解酶在AD样脑损伤中的作用将具有重要意义。
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