ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA

Identification of Protein
Spots in Silver-stained Two-dimensional Gels Based on Chemically Assisted
Fragmentation by MALDI-TOF-PSD Mass Spectrometry

CHEN Ping, NIE Song, XIE
Jin-Yun, LIANG Song-Ping*

( College of Life Science, Hunan Normal University,
Changsha 410081, China )

PENG Chong, LI Gui-Yuan*

( Cancer Research Institute, Xiangya Medical School,
Central South University, Changsha 410078, China )

Abstract        Guanidination
of the ε-amino group of lysine-terminated tryptic peptides,accomplished with
O-methylisourea hydrogen sulfate, converted lysine into homoarginine residues,
improving detection in MALDI-MS. Then tryptic peptides were labled with
sulfonic acid groups at the N-termini using 3-sulfopropionic acid NHS-ester
chemistry. The derivatives enhanced post-source decay (PSD) fragmentation
signals and produced a spectrum containing only y-ions. This facilitated de novo
peptide sequencing, so it is an important contribution to unambiguous protein
identification in proteome research. This method was successfully applied in
nasopharyngeal carcinoma(NPC) proteome study.

Key words     modification; MALDI-PSD
sequencing; protein identification

_________________________________________

Received: January 28, 2003   Accepted: April 9, 2003

This work was supported by the grants from
the National Natural Science Foundation of China (No.39990600) and the Major
State Basic Research Development Program of China (973 Program) (No.
001CB510208)

*Corresponding authors:

LIANG Song-Ping: Tel, 86-731-8872556; Fax,
86-731-8861304; e-mail, [email protected]

LI Gui-Yuan: Tel, 86-731-4805446, e-mail, [email protected]

相化学辅助MALDI-TOF质谱源后衰变技术对2D-胶银染蛋白质点的鉴定

陈平 聂松 谢锦云 梁宋平*

(湖南师范大学生命科学学院， 长沙 410081 )

彭聪 李桂源*

( 中南大学湘雅医学院肿瘤研究所，
长沙 410078 )

摘要      利用O–甲基异脲氢硫酸(O-methylisoureahydrogen
sulfate)修饰2D-胶上胰蛋白酶原位酶切后产生的Lys-肽， 使其具有Arg-肽的特性， 提高质谱测定的灵敏度， 然后用化学试剂3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯(3-sulfopropionic acid NHS-ester)
修饰Lys-肽及Arg-肽， 修饰的产物在进行PSD测序时能得到单一的y⁺离子系列， 有利于蛋白质酶解片段序列的从头解析， 为2D-胶上蛋白质点的准确鉴定提供有力的依据； 该方法应用于鼻咽癌细胞2D胶银染蛋白质点的鉴定取得可靠结果。

关键词   化学修饰； MALDI-PSD测序； 蛋白质鉴定

在蛋白质组的研究中，
对于2D-胶分离的蛋白质点的鉴定一般采用肽质量指纹图(PMF)分析方法。 但是PMF分析往往遭遇多种候选蛋白质的取舍问题， 由于各种因素干扰， 通过PMF在数据库中搜寻到的冠军蛋白质往往并非目的蛋白质， 因而导致模棱两可的鉴定。 这种情况出现的可能原因之一是在微量分析水平下目的蛋白质的片段覆盖率不够高，
该现象的产生是由于在MALDI条件下目的肽片段响应值太低。 实验已证实在MALDI条件下C端为Lys的肽(Lys-肽)在质谱分析中的离子信号强度明显低于C端为Arg的肽(Arg-肽)， 若胰蛋白酶消化片段中Lys-肽占主导， 则会造成质谱信号的信噪比降低，
从而减弱蛋白质的片段覆盖率； 另外，
蛋白质的共迁移使得在一个蛋白质点中可能存在两种或多种蛋白质， 因而产生复杂的酶解片段， 使得其解析变得困难； 除此之外， 当所鉴定的蛋白质发生了翻译后修饰，
而该信息并未包含在数据库中， 或者是所分析的样品蛋白质本身就是一个新型的蛋白质时，
在数据库中也搜寻不到相应的目的蛋白质， 因此造成PMF的鉴定困难［1～5］。
在我们的前期蛋白质组研究工作中， 只有不到50%的蛋白质点能通过PMF准确地鉴定［6～10］。

为了增加蛋白质鉴定的可信度，
获得一段蛋白质酶解肽片段内部序列信息通常是非常重要的。 在过去十几年中，
科学工作者一直在尝试利用质谱进行肽内部序列测定［11～14］。
近年来， 随着MALDI-TOF质谱源后衰变(post source decay, PSD)技术的改进和精确度、灵敏度的改善以及蛋白质数据库搜寻软件的发展，
利用MALDI-TOF质谱进行肽片段内部序列测定已成为一种流行的方法［15～17］。
但是， PSD技术仍然有着裂解的离子片段信号较弱以及碎片离子峰较复杂的缺点， 给图谱解析造成一定的困难。 为了克服这些缺陷， 科学工作者提出了一系列化学试剂用来修饰Lys-肽和Arg-肽［18～25］。 本文用O-甲基异脲氢硫酸修饰Lys-肽， 再用化学试剂3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯修饰Lys-肽及Arg-肽后进行PSD序列测定， 并将该方法应用于2D-胶分离的银染蛋白质点胰蛋白酶酶解肽片段的内部序列测定， 得到清晰准确的结果。

1 材料和方法(Materials and Methods)

1.1 材料

O–甲基异脲氢硫酸(O-methylisoureahydrogen
sulfate)、 3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯(3-sulfopropionic acid NHS-ester)、 Lys-肽(HGTVVLTALGGILK)、 Arg-肽(ADSGEGDFLAEGGGVR)包含在Amersham Biosciences 公司的CAF-MALDI sequencing kit 中； C18 ZipTip^TM为美国Millipore公司产品； 基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、 三氟乙酸(TFA)为美国Sigma公司产品； 乙腈为国产分析纯； 双蒸水为本实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 样品的衍生        (1) 赖氨酸侧链基团的保护肽及2D-胶分离蛋白质点胰蛋白酶原位酶解产物用C18 ZipTip柱在其溶液中缓慢地吸上压下， 重复数次以使其肽片段吸附在ZipTip头上； 取2 μl 0.5 mol/L O-甲基异脲氢硫酸和8 μl 0.25 mol/L碳酸钠(pH 11.7)混合， 将ZipTip在修饰剂中吸上压下数次， 最后使液体保持在柱子上， 放置在1.5 ml EP管中37 ℃保温2 h后去掉液体， 用0.1%TFA水溶液洗涤数次。 (2) N端的磺酸化新鲜溶解3-磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯于0.25 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 9.4)中， 制备成浓度为0.1 g/ml 的溶液， 取10 μl 于0.2 ml EP管中， 将含有样品的ZipTip头在其中吸上压下数次， 最后使溶液保持在柱上3 min， 再用50%的羟氨溶液过柱以去除不期望的侧链副反应。

1.2.2 MALDI-TOF分析样品制备     用0.1%TFA冲洗ZipTip柱数次除去盐及杂质， 将样品洗脱在3 μl 80%乙睛中(含5%TFA)。 取0.5 μl点于分析板上， 再取0.5 μl新鲜制备的饱和CHCA溶液(5 g/L)覆盖于样品上， 空气中自然干燥后测定质谱。

1.2.3 MALDI-TOF质谱测定     使用美国Applied
Biosystems公司Voyager
DE-STR飞行时间质谱仪进行。 氮气激光(337 nm, 脉冲宽度 3 ns)， 操作参数如下： 反射模式真空度为2.3×10⁷ Torr, 加速电压25 kV, 引出电压64.5%, 离子延迟提取150 ns, 质谱信号单次扫描累加50次； 源后衰减(PSD)模式真空度为2.3×10⁷
Torr, 加速电压 25 kV， 引出电压65%～80%， 离子延迟提取100～250 ns, 质谱信号单次扫描累加250次； 均为正离子检测。 质谱使用标准肽混合物血管紧张肽(angiotensin I， Mr为1296.6853)和促肾上腺皮质素片段(ACTH 18～39, Mr 为2465.1989)作为外标校正。

2 结果和讨论(Results and Discussion)

2.1 样品的固相衍生

样品的固相衍生分为两步，
由于C端为Lys的肽(Lys-肽)在质谱中的信号较弱，
而C端为Arg的肽(Arg-肽)在质谱中的信号较强，
故首先用化学试剂O-甲基异脲氢硫酸修饰Lys的ε-氨基，
使Lys的ε-氨基发生胍基化反应生成高精氨酸(homoarginine)， 增加质谱分析的灵敏度； 另外也可避免Lys的ε-氨基在下一步反应中被磺基化。 O-甲基异脲氢硫酸只专一性地修饰ε-氨基， 不会与N端发生反应， 也不修饰Arg-肽。 Lys的ε-氨基被修饰后，
质量增加+42原子质量单位(Amu)。 接着用３–磺酸丙酸N-羟基琥珀酰胺酯修饰样品的N端， 使其N端接上一个磺酸基团， 此时引入了一个负电荷到肽段的N端。 在进行质谱分析时， 若要形成正电荷模式， 样品质子化过程中需引入两个质子到肽片段上，
其中一个主要位于肽片段的C端， 另一个则在肽骨架上游动帮助肽链断裂。
经修饰后的样品在低能的PSD模式下也非常容易断裂， 且只在肽键处断裂， 即只得到b⁺和y⁺系列离子； 而在b⁺离子C端的正电荷被b⁺离子N端的磺酸负电荷中和后整个肽段呈中性，
在质谱分析中不会出现信号， 只有带有正电荷的y⁺离子系列方能被检测。 N端修饰后质量增加+136
Amu。

图1(A)为两个模式肽(Lys-肽， HGTVVLTALGGILK Mr为1378; Arg-肽， ADSGEGDFLAEGGGVR Mr为1536)以等摩尔比例混合后的质谱图，
由图可见Lys-肽的灵敏度比Arg-肽的灵敏度低大约10倍左右。 图1(B)为修饰后的图谱， Lys-肽(Mr为1556)的灵敏度明显提高。

所有的样品修饰步骤均在Millipore公司生产的C18 ZipTip上进行， 使用这种固相方法一方面可以达到脱盐、浓缩样品的目的， 对于2D-胶上低水平表达量的蛋白质点尤为有用； 另一方面对于衍生反应也极为有利， 衍生过程中可以随时更换衍生剂使肽片段不断与新鲜试剂反应以增加衍生率，
加入的衍生试剂及缓冲液等在反应后也极易通过对柱进行冲洗除去而不会造成样品的损失。 我们曾尝试采用液相衍生法， 但测定的结果背景杂乱， 衍生率不高， 因而也造成质谱分析信号较低。
因此认为样品固相衍生方法是一种简单、快速、高效、灵敏的方法。

2.2 样品的PSD测序

分别选取两个模式肽修饰后的峰(图1, Lys-肽Mr为1378+42+136=1556； Arg-肽Mr为1536+136=1672) 进行PSD测序， 所得结果见图2(A,C)。 同时，
对未经修饰的肽片段进行了PSD测序， 所得结果列于图2(B,D)。 由图可见，
未经修饰的肽片段的PSD图谱较为复杂， 片段离子峰既包含a+、 b⁺、 c+系列离子，
也包含x+、y⁺、 z+系列离子， 甚至还包含内部肽片段离子，
且离子系列峰又不完全， 给质谱图的从头解析造成了一定的困难；
而修饰后的肽片段的PSD图谱中只出现了y⁺离子系列， 且Lys-肽的14个氨基酸的y⁺1至y⁺14离子及Arg-肽16个氨基酸的y⁺1至y⁺16离子全部出齐， 肽片段离子峰的信噪比较高， 图谱极为清晰， 因此能毫不含糊地从头解析该两个肽片段的氨基酸序列。

Fig.1 MALDI mass spectrum of two model peptide(A) and MALDI mass spectrum of
two model peptide following guanidination and sulfonation(B)

Fig.2 PSD MALDI mass spectra obtained
from HGTVVLTALGGILK after modification (A), and before modification (B); from
ADSGEGDFLAEGGGVR after modification (C), and before modification (D)

对于2D-胶上的蛋白质点， 我们首先选取标准蛋白质进行了测定。 样品的酶解按本实验室以前报道的方法进行［26,27］。 图3(A, B)分别为磷酸化酶b原位酶解后经化学修饰和未经化学修饰的PMF图谱， 经对照发现图3(A)中1189.1811、 1491.1929、1562.2666、1609.3317、1702.1258、1825.3093和2253.4633峰有可能为被修饰的肽片段(图中用星号标出)， 选取这些片段峰进行PSD测定， 其中1562.2666、1609.3317、1702.1258、 1825.3093峰得到了清晰的y⁺离子信号， 分别与磷酸化酶b片段HLQIIYEINQR(Mr为1426.78)、 WPVHLLETLLPR(Mr为1473.86)、 DFNVGGYIQAVLDR(Mr为1566.79)、 ARPEFTLPVHFYGR(Mr为1689.89)吻合。 图4显示的是1562.2666与1702.1258两个峰的PSD图谱， 所有的y⁺离子峰全部出齐， 可以清晰地读出全部氨基酸序列。 从图3(A)可见， 1562.2666峰强度较高， 而1702.1258峰是一个强度非常低的峰， 但其PSD图谱仍然有较高的信噪比，
这是一个令人欣喜的结果， 说明该方法适宜于微量水平下的分析，
对于2D-胶微量蛋白质点的鉴定尤为适用。

Fig.3 The PMF spectrum of phosphorylase b after modification (A) and before
modification (B)

Fig.4 The PSD MALDI mass spectra obtained from fragment DFNVGGYIQAVLDR (A) and
fragment HLQIIYEINQR (B) of phosphorylase b

李桂源等在鼻咽癌细胞系HNE1中经过脂质体转染了一个新发现的与鼻咽癌相关的基因NAG4(文章待发表)， 观察其转染前后蛋白质表达水平的变化情况。
在对转染后的蛋白质经2D-胶分离后的差异蛋白质点进行鉴定时发现一些蛋白质用PMF方法鉴定后仍然不能确定其归属， 我们用上述报道的方法对鉴定结果不明确的点进行了进一步确证。
图5(A,B)分别显示的是其中一个蛋白质点(编号为PD2)的PMF和PSD图谱， 该蛋白质点的PMF数据在加利福尼亚大学建立的UCSF(University
of California, San Francisco) MS-Fit (http：//www.prospector.ucsf.edu/ucsfhtm3.2)数据库中搜寻， 结果列于第一位的纤溶酶原(plasminogen)和列于第二位的腺苷酸激酶(adenylate kinase)的积分(score)比排在他们后面的蛋白质的积分要高出很多，
但它们两者的积分在同一个数量级上， 因此无法判定究竟哪一种为目的蛋白质。
而图5(B)的PSD结果表明其中一个肽的部分序列为QTTPLIEYYR， 与列于第二位的腺苷酸激酶中的酶解片段LQAYHTQTTPLIEYYR完全吻合， 因此将其可靠地鉴定为腺苷酸激酶。
表1列出的是部分由PSD鉴定的NAG4基因转染鼻咽癌细胞系HNE1的差异表达蛋白质， 样品均由PMF获得不能确定的蛋白质信息后， 经PSD测定获得内部序列进行确认。
其中有4种下调蛋白质(PD)和两种上调蛋白质(PU)， 包括电压门控阴离子通道(L06132)、过氧化物歧化酶(X14322)、巯基特异抗氧化物蛋白(Z22548)、3羟脂酰CoA脱氢酶(U73514)和腺苷酸激酶(U54645)等， 其中还发现一种没有命名的蛋白质，
即表明该种蛋白质实际存在但功能未知， 那么这种蛋白质在鼻咽癌的产生和发展中究竟扮演了一个什么样的角色，
还有待进一步研究。

Fig.5
The PMF (A) and PSD (B) MALDI mass spectra from spotPD2 in 2D-gel of HNE1
transfected NAG4 gene

Table
1 The different protein of NHE1 transfected NAG4 gene identified by PSD

综上所述，
化学辅助的MALDI-TOF质谱PSD微量蛋白质内部序列测定技术具有快速、简便、高灵敏度、高准确性的特点，
如果不对样品进行Lys侧链的修饰， 每个样品的磺酸化反应(包括样品和化学试剂的吸附， 衍生样品的冲洗和洗脱)可在5 min之内完成， 且一次可平行处理多个样品，
适合蛋白质样品的高通量分析； 样品采用固相衍生的方法，
既能浓缩样品， 提高灵敏度， 也能方便、完全地去掉杂质， 使其分析背景非常干净； 且衍生后的肽片段在PSD测定时只产生唯一的y⁺离子系列， 有利于蛋白质酶解肽片段序列的从头解析，
能为2D-胶上微量蛋白质点的准确鉴定提供强有力的依据，
在蛋白质组学的研究中具有广阔的应用前景。

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