Cloning, Expression, and Antibody Production
of Mouse ISP2
HUANG Zhe-Ping， WANG Jian， YU Hao1， SHEN Wei-Xiong， HUANG Ping， TSO Jia-Ke， YANG Zeng-Ming1， SHEN Qing-Xiang*
(
National Laboratory of Contraceptive and Devices Research, Shanghai Institute
of Planned Parenthood Research， Shanghai 200032, China; 1College of Life Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China )
Abstract A cDNA
encoding mouse implantation serine proteinase 2 （ISP2）was amplified
from total cDNAs of mouse uterus implantation sites on D4.5 of pregnancy by
PCR, and sequenced（GenBank accession No. A442918）. DNA sequencing indicated that the ISP2 cDNA had an unreported 204
bp sequence at 3′ untranslated region besides the open reading frame encoding
279 amino acid residues, which was identical with literature. In order to
obtain recombinant ISP2（rISP2）， an
expression plasmid pGEX-4T-2/ISP2 was constructed and transformed into E.coli
BL21(DE3) strain. Expressed fusion protein GST-ISP2 was purified by SDS-PAGE
and digested with thrombin, and the digestion mixture was subjected to SDS-PAGE
again to recover rISP2. Rabbits were immunized using rISP2 as immunogen, and
the polyclonal anti-ISP2 antisera were obtained. Immunohistochemical analysis
using this antisera showed specific and high expression of ISP2 in mouse
endometrial gland epithelium in early pregnancy.
Key words ISP2； PCR； gene expression； antibody preparation
________________________________________
Received: March 5, 2003 Accepted: May 8,
2003
This work was supported by a grant from the
Major State Basic Research Development Program of China (973 Program)
(No.G1999055903)
Tel, 021-64049215-3407; Fax, 021-64046128;
e-mail, [email protected]
小鼠着床丝氨酸蛋白酶
2 cDNA的克隆、表达及抗体制备
黄哲平
王健 于浩1 黄萍 沈维雄
左嘉客
杨增明1 申庆祥*
( 上海市计划生育科学研究所国家计划生育药具重点实验室, 上海200032;
1东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨150030
)
摘要 以孕4.5天小鼠子宫着床位点总cDNA为模板,用PCR方法扩增获得着床丝氨酸蛋白酶2（ISP2）的cDNA。
序列分析表明， 该cDNA序列中的开放阅读框编码279个氨基酸， 并与文献报道完全相同， 但在3′非翻译区多204 bp， 已登录于GenBank（登录号： AF442819）。 为了获得重组ISP2（rISP2），
构建了pGEX-4T-2/ISP2表达质粒， 进而在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合蛋白质GST-ISP2, 经SDS-PAGE回收的融合蛋白质用牛凝血酶酶切， 再经SDS-PAGE回收获得rISP2。 用rISP2作为免疫原免疫家兔获得ISP2多克隆抗血清。 用该抗血清进行免疫组化研究表明， ISP2在妊娠早期的小鼠子宫内膜腺上皮有特异性的高表达。
关键词 ISP2； PCR； 基因表达；
抗体制备
胚胎着床是妊娠过程的一个关键步骤，
也是生殖生物学领域的研究热点之一。 虽然对于着床过程及其调控机制已进行了许多研究，
但仍有许多问题还不清楚。 当母体子宫内膜在激素作用下呈接纳胚泡状态时，
胚泡必需及时从透明带中逸出， 与子宫内膜附着，
从而启动胚泡着床过程。 而在胚泡从透明带逸出和侵入母体子宫的过程中，
蛋白酶可能发挥重要作用［1］。 目前已有不少有关小鼠和其他动物的胚泡从透明带中逸出和启动植入子宫内膜的研究分析报道，
鉴别出一些参与该过程的酶蛋白分子。 其中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与尿激酶型纤溶酶激活物（uPA）分子曾被认为是在胚泡侵入子宫内膜过程中起关键作用的酶［2~4］， 但已有研究表明这种类型的蛋白酶不是这一过程所必需的［5,6］。 体内和体外试验中，
胚泡从透明带逸出的时间和方式均不相同， 在体内，
没有观察到体外孵化过程中出现的囊胚腔膨胀和透明带局部溶解、 穿孔现象，
而是透明带整体变薄后逐渐被消化， 提示子宫内膜可能合成分泌能溶解透明带的蛋白酶［7~10］。
最近，
我们在应用差减cDNA文库筛选小鼠胚泡着床相关基因时［11］发现， EST73＃的DNA序列与O’Sullivan［12］等所报道的着床丝氨酸蛋白酶2
(implantation serine proteinase 2， ISP2)的开放阅读框中的部分序列完全一致。 有关ISP2的研究报道很少， O’Sullivan［12］等用原位杂交方法研究ISP2的表达， 表明它是一种在小鼠围着床期（4.5~8.5天）子宫内膜腺上皮表达的丝氨酸蛋白酶，
它的表达只受孕激素而不受雌激素的调控， 提示ISP2很可能是一种溶解透明带的蛋白酶。 后续研究还表明它与着床丝氨酸蛋白酶1共表达， 两者很可能形成异四聚体［13］。 但至今未见ISP2的基因表达和抗体制备的报道， 因此我们试图用抗ISP2抗体进一步研究ISP2在着床过程中的作用。 本文报道了ISP2 cDNA的克隆、 重组蛋白质的表达和分离纯化、 抗ISP2多克隆抗体的制备及免疫组化分析结果， 这为进一步研究ISP2的生物功能打下了基础。
1 材料和方法(Materials and Methods)
1.1 材料
6~7周龄雄性BALB/C小鼠（体重35~40克）， 雌鼠BALB/C小鼠（体重25~30克）， 均购自上海西普–必凯实验动物有限公司。
孕4.5天小鼠着床位点子宫总cDNA系本实验室合成［11］。 PCR引物由上海博亚公司合成：
引物1： 5′-ATG CTG ATC CAG CTG TGC C-3′, 对应于已知的小鼠ISP2 cDNA核苷酸序列1～19［12］；
引物2： 5′-AAT TCG CGG CCG CT［15］ -3′。
DNA限制性内切酶和修饰酶、 pMD18-T载体购自TaKaRa公司； 质粒pGEX-4T-2和牛凝血酶为Amersham Biosciences公司产品； 琼脂糖购自Promega公司； 细菌培养用胰化蛋白胨、 酵母提取物和琼脂为Oxiod公司产品； Vectastain ABC-AP kit购自Vector Laboratories（Burlingame, CA）； 其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 PCR反应 以孕4.5天小鼠着床位点总cDNA为模板［11］，
用引物1 和2进行PCR扩增。 反应液含： 2 μl每种引物（5 μmol/L）、 2.5 μl 10×PCR缓冲液、 2 μl每种dNTP（2.5 mmol/L）、 2 μl 25 mmol/L MgCl2、 2 μl模板、 0.3 μl（1.5 u）Taq DNA聚合酶， 加H2O至总体积25 μl。 PCR条件： 94 ℃ 2 min； 94 ℃ 40 s， 62 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min， 5个循环； 94 ℃ 40 s， 50 ℃ 1 min， 72 ℃ 2 min， 25个循环； 最后一个循环72 ℃ 延伸10 min； 4 ℃ 30 min。
将ISP2 cDNA作双向序列测定。
1.2.3 融合蛋白质基因表达及产物纯化 将ISP2 cDNA亚克隆至表达载体pGEX-4T-2中， 获得表达质粒pGEX-4T-2/ISP2， 转化大肠杆菌BL21（DE3），
用IPTG诱导GST-ISP2融合基因的表达， 并根据SDS-PAGE电泳结果确定最佳表达条件。 用溶菌酶裂解法收集表达产物GST-ISP2（包涵体沉淀）［14］， 将其溶解于10 g/L SDS， 经SDS-PAGE、 0.25 mol/L KCl染色后， 从胶上切下GST-ISP2蛋白条带,磨碎后用10 g/L SDS浸泡， 离心后取上清液， 对PBS(0.14 mol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 10.1 mmol/L Na2HPO4， 1.8 mmol/L NaH2PO4)透析， 用Bradford方法作蛋白质定量［15］。
1.2.4 融合蛋白质的酶切和ISP2的纯化 将纯化得到的GST-ISP2浓度调整到1 g/L， 加入不同浓度的牛凝血酶，
于37 ℃分别于1、 ２、
４、 ８、 12 h取适当反应产物作SDS-PAGE分析， 以GST， GST-ISP2为对照， 以确定最适条件。 按最佳反应条件扩大酶解反应体系， 酶切产物用分离融合蛋白质的方法分离纯化，
获得纯的rISP2。
1.2.5 多克隆抗体的制备 按常规方法免疫家兔。 首次免疫时， 按每只1 mg的剂量， 将纯化得到的rISP2溶于生理盐水（终浓度为2
g/L）， 加入等体积的弗氏完全佐剂，
充分混匀后皮下多点注射； 加强免疫， 抗原用量同初次免疫， 加弗氏不完全佐剂， 于前次免疫后的２~３周进行。 最后一次加强免疫后的８天放血，
取血清。
1.2.6 Western印迹 Western印迹按文献［16］方法进行。 以GST为对照， 将融合蛋白质GST-ISP2及其酶切产物作SDS-PAGE， 并转移到硝酸纤维素膜上， 45 g/L脱脂奶粉封闭， 以抗血清（1∶200稀释）为一抗， 羊抗兔IgG-AP（1∶5000）为二抗进行杂交， NBT、 BCIP显色15 min。 另外，
还取孕小鼠和非孕小鼠子宫的冲洗物及组织蛋白质的抽提液， 用上述方法作Western 印迹分析。
1.2.7 小鼠子宫组织切片的免疫组化分析 小鼠及其处理、 组织切片的制作及免疫组化参照文献［17］进行。 组织切片脱腊至水，
马血清封闭， 37 ℃温育1 h，
加入兔抗小鼠ISP2多克隆抗血清（1∶150）， 于4 ℃温育12~16 h， PBS洗3次。 加入生物素结合的山羊抗兔IgG抗体， 25 ℃温育30 min， 1×PBS洗3次。
加入碱性磷酸酶标记的链霉亲合素， 25 ℃温育30 min， 用PBS洗3次。 显色： 用美国Vector Laboratories提供的Vector Red碱性磷酸酶底物试剂盒25 ℃显色20 min。 同时用左旋咪唑（levamisole）抑制内源性碱性磷酸酶活性，
抗体结合部位将显红色。
2 结果（Results）
2.1 ISP2 cDNA的获得
为了获得ISP2 cDNA， 根据EST73#与GenBank中已知基因序列的同源性， 分别设计相应的5′端引物和3′端引物。 以孕4.5天小鼠着床位点总cDNA为模板［11］，
用PCR扩增获得了相应的cDNA。 该cDNA全长1044
bp(GenBank登录号AF442819)， 包括开放阅读框的核苷酸序列(编码 279个氨基酸) 和3′端非翻译区核苷酸序列(图1)。
该cDNA的开发放阅读框的核苷酸序列与 GenBank中ISP2（登录号AF305425）的序列（只有开放阅读框核苷酸序列和终止密码）相同， 但我们的序列中，
还有3′端非翻译区核苷酸序列。
Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the cDNA of
mouse EST73#
EST
sequence was underlined.
2.2 表达质粒pGEX-4T-2/ISP2的构建和融合蛋白质GST-ISP2的基因表达
将克隆在pMD18-T中的ISP2 cDNA用SalI 酶切， 在四种dNTP存在下， 用DNA聚合酶I（Klenow大片段）将其末端补平， 然后用NotI酶切， 低熔点胶回收ISP2 cDNA片段， 克隆入pGEX-4T-2的SmaI和NotI位点之间， 获得表达质粒pGEX-4T-2/ISP2（图2）。 GST-ISP2融合基因编码512个氨基酸， 预期分子量为56.3 kD。
Fig.2 Schematic diagram of the construction of expression plasmid
pGEX-4T-2/ISP2
表达质粒转化大肠杆菌BL21， 筛选表达菌株。
含表达质粒的单克隆菌在LB培养基中（含50 mg/L的氨苄青霉素）37 ℃培养至A600为0.6~0.8， 加入不同浓度的IPTG诱导表达4 h。 收集菌体， 用溶菌酶裂解法分离上清液和沉淀， 作SDS-PAGE分析， 结果表明， 经IPTG诱导后融合蛋白质获得高效表达， 表达的融合蛋白质以包涵体形式存在于裂解后的沉淀中， 诱导物IPTG的浓度以 0.5
mmol/L为最适浓度(图3, 泳道5~7)。 表达的融合蛋白质分子量为56 kD，与预期的分子量大小一致。 为了进一步证实融合蛋白质的表达,表达菌裂解的沉淀部分作SDS-PAGE后, 以抗GST抗体为一抗进行Western
印迹分析,结果显示分子量为56 kD的融合蛋白质能与抗GST抗体专一结合， 这进一步说明此融合蛋白质可能是GST-ISP2（图4， 泳道1）。
Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion gene expression pro-duct in E. coli
1, protein molecular weight marker; 2,
the supernant of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.05 mmol/L IPTG induction; 3,
the supernant of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.1 mmol/L IPTG induction; 4,
the supernant of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.5 mmol/L IPTG induction; 5,
the pellet of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.05 mmol/L IPTG induction; 6, the
pellet of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.1 mmol/L IPTG induction; 7, the
pellet of bacteria ISP2/BL21 lysate with 0.5 mmol/L IPTG induction; 8, the
lysate of bacteria BL21; 9, the lysate of bacteria GST/BL21 with 0.5 mmol/L
IPTG induction; 10, the lysate of bacteria ISP2/BL21 with 0.5 mmol/L IPTG
induction.
Fig.4 Western blot analysis of the pellet of bacteria ISP2/BL21 lysate using
antibody against GST as first antibody
1,the pellet of bacteria
ISP2/BL21 lysate; 2,the purified GST.
2.3 融合蛋白质GST-ISP2的纯化、 酶切和ISP2的制备
表达菌株ISP2/BL21经0.5 mmol/L的IPTG诱导后， 溶菌酶裂解法裂解细菌［14］， SDS-PAGE分离纯化融合蛋白质。 从胶上切下相应条带， 研碎后用10 g/L SDS浸泡， 上清液对PBS透析， 获得纯化的融合蛋白质，
经定量后用凝血酶酶切（37 ℃， 12 h），
再作SDS-PAGE， 从胶上回收所需的ISP2。 融合蛋白质GST-ISP2经牛凝血酶酶切后， SDS-PAGE显示25 kD和31.5 kD大小的两条带,分别与GST（226个氨基酸）和ISP2（286个氨基酸，
其中7个为接头处的氨基酸）的预期分子量一致（图5， 泳道3和4）。
Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified ISP2
1, protein molecular weight marker; 2,
purified GST; 3, purified ISP2; 4, GST-ISP2 digested with thrombin; 5, purified
GST-ISP2; 6, the pellet of bacteria ISP2/BL21 lysate.
2.4 Western印迹检测ISP2多抗血清的滴度
最后一次加强免疫后8天放血， 取血清。
由于ISP2只能在10 g/L SDS中溶解， 无法用ELISA 方法检测， 只能采用Western 印迹检测抗体。 融合蛋白质GST-ISP2经牛凝血酶酶切后作SDS-PAGE， 转移至膜上， 作Western印迹， 以不同稀释度（1∶100、 1∶200、 1∶400、 1∶800）稀释的抗血清作一抗， 结果表明一抗1∶200稀释时， 仍在特定的位置（GST-ISP2和ISP2）显出印迹条带（图6， 泳道3和5）。 这结果表明， 产生的抗体能专一地与ISP2反应， 即抗体具有专一性， 且其效价能满足Western 印迹的要求。 另外， 小鼠子宫组织蛋白质抽提液和冲洗物的Western 印迹分析结果显示， 孕7天小鼠子宫组织蛋白质抽提液和冲洗物 (图7， 泳道1和2)有一48 kD的条带， 而非孕小鼠子宫组织蛋白质抽提液和冲洗物无此条带(图7， 泳道3和4)， 这进一步说明了ISP2在孕期小鼠子宫的表达。 表达产物的表观分子量为48 kD， 这是因为该蛋白质有两个Asn糖基化位点， 在体内表达的蛋白质已被糖基化。
Fig.6
Western blot analysis of the antigen using the antibody against ISP2 as first
antibody
1, the pellet of bacteria ISP2/BL21
lysate; 2, purified GST-ISP2; 3, GST-ISP2 digested with thrombin; 4, GST; 5,
the purified rISP2.
Fig.7
Western blot analysis of mouse uterus tissue extract and the protein washed
from mouse uterus
1, tissue extract of mouse uterus on D7
of pregnancy; 2, the protein washed from mouse uterus on D7 of pregnancy; 3,
tissue extract of unpregnant mouse uterus; 4, the protein washed from
unpregnant mouse uterus; 5, purified GST-ISP2 fusion protein; M, protein
molecular weight marker.
2.5 免疫组化
用上述抗血清为一抗进行免疫组化实验，
分析ISP2体内表达情况。
O’Sullivan等［12］的原位杂交结果表明，
ISP2仅在孕小鼠（4.5～8.5天）的子宫腺体中表达，
并受孕激素而不受雌激素调节。 我们用小鼠的子宫组织切片作了一系列免疫组化分析(结果未全部出示),结果表明ISP2在围着床期（5～8天）子宫腺体中表达［图8（B）箭头所指的红色区域］， 与文献报道的原位杂交检测ISP2 mRNA的分布结果一致， 更进一步说明该抗体具有专一性。 图8（A）、 （B）分别为孕1天小鼠子宫和孕6天小鼠子宫着床部位的免疫组化分析结果， ISP2在孕6天小鼠子宫着床部位的腺体中有表达，
而非孕小鼠无表达。 图8(C)则为用免疫前血清为一抗作的孕6天小鼠着床位免疫组化分析（阴性对照）。
Fig.8 Immunostaining test of mouse with the polyclonal antisera
(A)D1 mouse uterus, using polyclonal
antiserum as first antibody (40×). (B) D6 mouse uterus, using polyclonal
antiserum as first antibody (40×), the arrow indicates mouse endometrial
glands. (C)D6 mouse uterus, negative control, using preimmunoantiserum as first
antibody (40×).
3 讨论（Discussion）
有关体内胚泡从透明带逸出的具体过程和机制的研究，
提示子宫内很可能存在一种溶解透明带的蛋白酶。 国外初步研究表明， ISP2是一种在小鼠围着床期（4.5～8.5天）子宫腺体中表达的分泌型丝氨酸蛋白酶，
它的表达受孕激素而不受雌激素的调节， 不依赖胚胎的存在，
提示其可能在胚泡逸出过程中发挥重要作用［12］， 但有关ISP2的研究还很少。
我们在差减筛选小鼠胚泡着床相关基因时获得的EST中， 经检索，
其中一个EST与ISP2开放阅读框的核苷酸序列相应部分完全相同。
Northern 印迹结果显示， 在孕4.5天小鼠的着床位点和非着床位点均为高表达（结果未出示）。
GenBank中只有ISP2的开放阅读框的cDNA序列（登录号： AF305425）。 我们用PCR的方法， 扩增获得了包括3′端非翻译区的ISP2的cDNA，
它长1044 bp， 编码279个氨基酸（图1）。 在编码的279个氨基酸中， 有125个为疏水性氨基酸， 预示该蛋白质的水溶性很差， 这给重组蛋白质的分离纯化带来极大的困难。
为了获得ISP2， 以制备多抗，
我们应用GST表达系统表达融合蛋白质GST-ISP2。 虽然融合蛋白的表达量很高，
电泳结果显示目的蛋白质以包涵体形式存在于沉淀中（图3， 泳道5~7）。 因此首先要摸索包涵体的溶解条件，
我们先后用过以下溶液： 6 mol/L盐酸胍， 1% Triton， 4 mol/L 尿素， 15 g/L十二烷酰肌氨酸， 10 g/L SDS， 结果表明， 只有15 g/L十二烷酰肌氨酸和10 g/L SDS才能完全溶解融合蛋白质。 但用这种方法得到的蛋白质溶液中含有去垢剂，
使GST-ISP2不能被谷胱甘肽 Sepharose 4B树脂吸附， 因此不能用常规的GST纯化方法获得GST-ISP2， 只能用SDS-PAGE， 从胶上直接回收融合蛋白质。 融合蛋白质经凝血酶酶切后，
也只能用 SDS-PAGE从胶上回收所需的ISP2。 此外， 我们曾将ISP2 cDNA分成两段(分别编码153和125个氨基酸)，
分别与GST基因融合表达，
结果表明此两个融合蛋白质的溶解度与GST-ISP2一样， 只能溶解于含去垢剂的溶液。
值得指出的是，
我们曾试用融合蛋白质GST-ISP2免疫家兔， 结果产生的抗体主要是抗GST， 而ISP2抗体的滴度很低， 其原因可能是ISP2与GST 连接后空间构象发生了变化，
从而改变了其原有的抗原决定簇； 另一种可能的原因是ISP2的抗原决定簇没改变， 但被GST所掩盖［18］。 此外我们还用过含ISP2的胶， 研磨后加入佐剂免疫家兔，
也未能诱发抗体产生。 最后， 用上述方法才获得较高滴度的ISP2抗体。 蛋白质的分离纯化很困难， 这可能是该抗体未见报道的原因之一。
用上述方法制备的ISP2抗体， 进行了Western 印迹和免疫组化分析， 其结果表明该抗体具有一定的特异性。 这为今后进一步阐明ISP2在胚胎着床过程中的作用及其机制打下了基础。
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