ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA

Short Communication

Thermodynamic and Kinetic
Analysis of Unfolding of P23k Protein Isolated from Spinach Photosystem II

TAN Cui-Yan, XU
Chun-He¹, SHEN Jun-Ren², SAKUMA Shinsuke²,
YAMAMOTO Yasushi², BALNY Claude³, RUAN Kang-Cheng*

(Key Laboratory of
Proteomics, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for
Biological Sciences, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China； ¹ Institute of
Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, the
Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China； ² Department of
Biology, Faculty of Science, Okayama University， Japan； ³ Institut National
de la Santé et de la Recherche Médicale, INSERM U 128, IFR 24, CNRS,
Montpellier, France)

Abstract        The
unfolding of 23kD (P23k) protein isolated from spinach photosystem II particle
was studied by high pressure and fluorescence spectroscopy. The thermal
equilibrium study indicated that the protein could be totally unfolded by 180
or 160 MPa at 20 ℃ and 3 ℃, respectively. The standard free energy and standard
volume change of the protein for unfolding at 20 ℃ is 23.45 kJ/mol and －150.3 ml/mol, respectively.
Kinetics study indicated that at 20 ℃ the activation volume for unfolding, ΔVu,
was negative (－66.2 ml/mol),
meanwhile the activation volume for folding, ΔVf, was positive (84.1 ml/mol).
The rate constants for folding and unfolding (K0f, K0u) were 1.87 s^－1 and
1.3×10^－4 s^－1, respectively, these results provide
some clues to explain why the protein is so sensitive to pressure.

Key words     fluorescence
spectroscopy； high
pressure technique； protein unfolding

_______________________________________

Received： April 22, 2003     Accepted： May 14, 2003

This work was supported by a grant from the
National Natural Science Foundation of China (No.30070164)

*Corresponding author： Tel, 86-21-54921168； Fax, 86-21-54921011； e-mail, [email protected]

高压力是研究蛋白质去折叠的一个很有力的工具，
近年来已有许多报道［1～9］。
在我们的一系列研究中， 发现光合作用系统II的外周蛋白之一–33kD蛋白是一个理想的研究模型， 这不仅由于该蛋白质分子仅有1个色氨酸残基， 其包埋在一非常疏水的环境中，
更重要的是该蛋白质具有较低的自由能， 用200 MPa左右的压力即可使该蛋白质完全去折叠，
很容易开展研究， 因而获得了许多有意义的结果［8］。 然而在许多其他的蛋白质去折叠研究中，情况却不是这样，
常常需要很高的压力方能使其去折叠， 如牛胰蛋白酶在650 MPa下仅发生部分去折叠， 形成融球态［5］。 因此， 人们非常希望能多找到一些类似33kD蛋白的蛋白质作为模型来研究蛋白质的折叠–去折叠。 近来， 我们对光合作用系统II中另一个外周蛋白开展了研究， 由于其分子量为23 kD， 故常被称为23kD蛋白(以P23k表示)［10,11］。 我们发现使该蛋白质发生完全的去折叠所需的压力比33kD蛋白还要低近20 MPa， 是迄今为止所有已研究的蛋白质中最低的。
现将目前得到的一些热力学与动力学研究研究结果报道如下， 以期引起同行注意, 为进一步开展更深入的系统研究打下基础。

1    材料和方法（Materials and
Methods）

1.1   材料

P23k是菠菜光合作用系统II含有的3个外周蛋白中的1个， 对维持光合作用系统II的稳定和生物功能有重要作用。 由于其分子量为23 kD， 故常被称为23kD蛋白。 P23k的一级结构已经测出， 分子中含有2个色氨酸和4个酪氨酸残基［10］。 从菠菜中制备P23k系按Ghanotakis等［11］的方法进行，
制得后的蛋白质按1 g/L 的浓度溶于0.05 mol/L pH 5.5 MES 缓冲液中, 贮于－20 ℃待用。

1.2   稳态荧光测量

荧光光谱等荧光参数的测量系在AB2荧光分光光度计或SLM48000分光光度计上进行。 荧光光谱的定量分析采用光谱质量中心（CSM）， 其定义为：

<ν> = Σνi・Fi/ΣFi                                                                           (1)

其中，
νi是波数， Fi是在νi处的荧光强度［4,5,8］。 在实验中的激发波长为295 nm， 该波长一般只能激发蛋白质中的色氨酸（Trp）残基［8］。 蛋白质的去折叠的程度（α）由下式确定：

α= ［1 + q (<ν>P－<ν>u)/(<ν>n－<ν>P)］^－1                                (2)

其中q为蛋白质去折叠态与天然态的荧光量子产率比， <ν>P是在压力为P时的CSM， <ν>u和<ν>n分别是蛋白质去折叠态与天然态的CSM。 蛋白质去折叠的标准自由能和标准体积变化按照Li等［2］的方法计算。

1.3   蛋白质去折叠动力学测量

P23k蛋白去折叠的动力学测量系在AB2荧光分光光度计上进行， 该仪器的高压样品室与一个由INSERM U 128设计研制的压力跃变装置相联， 该装置可在10 ms的时间里产生0.1～30 MPa正跃变或负跃变。 有关动力学数据的处理以及折叠和去折叠反应的活化体积（ΔVf与ΔVu）以及在常压下折叠和去折叠反应的速度常数(K0f, K0u)的计算均采用Royer等［12］的方法。

2    结果和讨论 (Results and
Discussion)

2.1   P23k蛋白在压力下的去折叠

由不同压力下的P23k蛋白的色氨酸荧光谱［图1(A)］可知， 其最大发射波长λmax为325 nm， 表明蛋白质分子中的2个色氨酸残基位于较疏水的环境中。 随着压力由0.1 MPa(1大气压)逐渐升高时，
荧光光谱的最大发射波长λmax逐渐红移， 表明蛋白质中的Trp残基由于发生去折叠而逐渐暴露于溶剂中。 当压力达到180 MPa或更高时， λmax从325 nm移至350 nm， 其与自由色氨酸在水溶液中的λmax一致, 指明在180 MPa时蛋白质已完全被去折叠， 从而使分子中的Trp残基暴露于溶剂中。 显然， 这一去折叠是由压力引起的［8］。 图1(B)是将图1(A)中各荧光发射谱的光谱质量中心与对应的压力作图, 从图中可以清楚看出， 当压力逐渐升高时， CSM值变小， 意味着荧光发射谱逐渐红移，
与上述λmax 红移一致。 当压力达到180 MPa或更高时， CSM值不再发生变化， 出现了一个平台， 表明P23k蛋白已被压力完全去折叠。 图1(B)也给出了P23k蛋白完全去折叠后， 逐步将压力从200 MPa释放时相应荧光发射谱的CSM变化。 可以发现， 除了有轻度的滞后外， 当压力回到0.1 MPa时， CSM基本上回到了原值， 这一结果说明释压时该蛋白质发生了重折叠, 并由此得知， 该蛋白质由压力引起的去折叠是可逆的。
由图2中的CSM值， 根据公式2计算出P23k蛋白的去折叠的自由能与标准体积变化分别为23.45 kJ/mol和－150.3 ml/mol。 值得指出的是, 180 MPa即可引起蛋白质的完全变性，
这在以前的研究中是很少观察到的［1～9］。

Fig.1
The unfolding of P23k induced by pressure

(A) The tryptophan fluorescence spectra of
P23k under different pressures. The pressure from top to bottom： 0, 20, 40, 80, 100, 120, 140, 160,
180, 200, 220 MPa. The excitation wavelength, 295 nm; protein concentration,
0.1 g/L in 0.05 mol/L MES buffer, pH 5.5; temperature, 20 ℃.(B) The center of
spectral mass of the P23k upon increasing (□) and releasing pressure(●).

2.2   温度对P23k蛋白去折叠的影响

图2给出了P23k蛋白在不同温度下的去折叠曲线随压力的变化。 从中可以发现，
在3～45 ℃的温度范围内， 随着温度的不同，
该蛋白质完全去折叠所需的压力有所差异， 从160 MPa至200 MPa不等。 该蛋白质不同温度下去折叠的自由能和标准体积变化列在表 1中， 结合图2不难看出， 在10～20 ℃的温度范围内时， 该蛋白质最为稳定， 这一结果与表中的不同温度下的P1/2 (P1/2是使50%的蛋白质发生去折叠所需的压力)十分吻合［ 8 ］。 有意思的是， 图3中显示的去折叠平衡常数的自然对数与温度倒数的关系呈现非线性，
其拐点正在10 ℃左右， 与上述的稳定性一致， 即随着温度的升高， 在3～10 ℃范围内， 该蛋白质的稳定性增强， 而在10～45 ℃范围内， 温度的升高引起蛋白质变得较易发生去折叠。
类似的非线性现象在我们以前的研究中［5,8］以及Royer等［12］的研究中也有所发现，
其机制目前尚不清楚， 需要进一步的研究。

Fig.2 The unfolding curves of P23k at different temperatures

The
temperature for curves from left to right：○, 3 ℃；�, 45 ℃； □, 10 ℃；●, 35 ℃；△, 20 ℃.

Table
1 The △G and P1/2 of P23k at different temperature

*P_1/2,
half-unfolding pressure.

Fig.3
The temperature dependence of the natural logarithm of the equilibrium constant
for unfolding of P23k

The equilibrium constants were calculated
from the data for the unfolding of the protein at each temperature according to
the description in Materials and Methods. All the experimental condition were
the same with in Fig.1 except the temperature.

2.3   P23k蛋白去折叠的动力学研究

图4是P23k蛋白在不同的压力正跃变后 Trp荧光强度(330 nm 处)随时间的变化。
从前文可知, 这一变化可分别用来跟踪该蛋白质的去折叠动力学过程。 从图4可以看出, 该蛋白质去折叠过程的表观速率是较慢的， 在100 MPa下， 驰豫时间在60 s左右。 在数据处理中发现， 所有的荧光强度随时间的变化均可拟合成单指数函数， 表明该蛋白质的去折叠反应是一个二态过程，
与上述稳态荧光研究的结果一致。 拟合得到的各表观速度常数Kapp与对应的压力作图所得的结果表明(图5), Kapp随压力的变化呈二相性， 即在120至150 MPa范围内， Kapp随压力的升高而变小， 但在压力高于150 MPa时， Kapp则随压力升高而增加。 这表明随压力的增加， 该蛋白质的去折叠和重折叠的速度常数变化的趋势是相反的［11］, 这一结论在下文中速度常数的推算中得到了证实。

 

Fig.4
The relaxation profiles of P23k fluorescence intensity after pressure jumps

Solid lines through the points represent
fits to a single exponential function. The excitation wavelength, 295 nm；the detective wavelength, 330 nm； protein concentration, 0.1 g/L in
0.05 mol/L MES buffer, pH 5.5； temperature, 20 ℃； pressure jumps were between 12 and 25 MPa over a range from 95
(top) to 200 MPa (bottom).

根据图5中的Kapp值， 可计算得到的该蛋白质在各相应压力下的去折叠和折叠反应的速度常数Kf和Ku (表2), 由这些数值对压力作图用外推的方法可得到在0.1 MPa(1个大气压)下的速度常数以及去折叠和折叠的活化体积［12］， ΔV^‡_u和ΔV^‡_f。 其中折叠反应的活化体积为正值（84.1 ml/mol）， 而去折叠反应的活化体积为负值（－66.2 ml/mol）， 这意味着增加压力， 将使折叠反应减慢而使去折叠反应增快。 这一结果与上述观察到的高压力能促进P23k蛋白去折叠现象完全一致, 从反应动力学解释了为什么高压力可使蛋白质发生去折叠。 在常压下， P23k蛋白的折叠速度常数与去折叠反应的速度常数 (K0f, K0u) 分别为1.87 s^－1 和1.3×10^－4 s^－1。 K0f 和 K0u之间的差别不是很大， 仅为14 400倍左右， 这就解释了为什么P23k蛋白如此容易被高压力去折叠。 由动力学参数推算出的热力学参数—去折叠的自由能和标准体积变化分别为23.36 kJ/mol和－150.0 ml/mol， 它们与用热力学平衡研究得到的相应值十分一致(表1)， 这一方面说明我们的热力学、动力学实验结果是十分可靠的, 另一方面也说明用二态过程来研究P23k蛋白的去折叠反应是正确的。 另外， 研究结果也表明， P23k是一个较为理想的用于折叠–去折叠研究的模型蛋白质， 对此我们将进行更深入的研究。

Fig.5
The pressure dependence of apparent rate constant of P23k

The
apparent rate constants were obtained from the relaxation profiles partially
shown in Fig.4 by fitting as a single exponent function.

Table
2   The Ku under various pressures

 

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