(03120)Shang Liang: Knockout tyrR in E. coli and Effect on Phenylalanine Biosynthesis

Knockout
of tyrR Gene in Escherichia coli and Its Effects on the
Phenylalanine Biosynthesis

SHANG
Liang, FAN Chang-Sheng*, JIN Rui-Liang,
LIU Dong-Xin, WANG Jian-Gang, YIN Jun, SONG Da-Xin

( Department of Microbiology,
School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433,China )

Abstract TyrR is a global regulation protein encoded by tyrR gene which
controls several transcriptional units involving biosynthesis and
transportation of aromatic amino acids in Escherichia coli. In this work, the
tyrR gene was knocked out by a double-cross homologous recombination. The tyrR－ mutant was verified by structural
identification by PCR and sequencing, and functional demonstration using lacZ reporter
gene. In tyrR－ mutant, the activities of two
key enzymes in the phenylalanine biosynthesis pathway, whose expression was
controlled by TyrR, DAHPS and AT, had been shown to elevate by a 1.08-fold and
2.70-fold compared with the parent strain, respectively. The yield of
phenylalanine biosynthesis in the mutant was 1.59 times higher than that of
wild type strain. The repression on the transcription of aroP, encoding an
aromatic amino acid permease, was eliminated, resulting in a 70.2% increase of
the aromatic amino acid transportation in tyrR－
mutant strain.

Key
words     tyrR; gene knockout;
phenylalanine biosynthesis; metabolic regulation; Escherichia coli

_________________________________________

Received:
April 14, 2003        Accepted:
May 23, 2003

This
work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of
China (No. 30070020)

*Corresponding
author: Tel, 86-21-65642808; Fax, 86-21-65650149; e-mail, [email protected]

大肠杆菌tyrR基因剔除及其对苯丙氨酸生物合成的影响

商量    范长胜*    金瑞良     刘东信     王建刚     尹隽    宋大新

( 复旦大学生命科学学院微生物学系, 上海 200433 )

摘要       TyrR是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成和运输途径中的一种全局性调控蛋白质。 采用双交换同源重组的方法定位突变大肠杆菌染色体tyrR基因,
在该基因中插入带有卡那霉素抗性基因的DNA片段, 使之失活,
实现基因剔除。 经PCR、 DNA测序、
lacZ报告基因等多种方法证实了基因剔除的可靠性。 tyrR基因剔除后, 大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受TyrR蛋白调控的关键酶的酶活力有所提高： 3-脱氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS, 由aroG编码)酶活力提高了1.08倍, 转氨酶(AT,
由tyrB编码)酶活力提高了2.70倍; 突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高了1.59倍; 同时, 与芳香族氨基酸运输相关的通透酶基因aroP(P) 的阻遏被解除, 细胞运输芳香族氨基酸的能力提高了70.2%。

关键词   tyrR; 基因剔除; 苯丙氨酸生物合成; 代谢调控;
大肠杆菌

苯丙氨酸是人体的必需氨基酸之一, 在日常生活中用途广泛, 如用于抗癌制剂、 氨基酸输液、 食品添加剂、 甜味剂制作等。 目前市场所需的苯丙氨酸主要来源于微生物发酵法和酶法, 因此, 开展对苯丙氨酸的生物合成代谢途径及其调控机制的研究, 对于构建生产苯丙氨酸的基因工程菌株具有相当重要的意义, 同时对人类苯丙酮尿症治疗研究及生物工程药物筛选也具有潜在的价值。

微生物合成苯丙氨酸的途径长, 代谢调控复杂。 它与酪氨酸、 色氨酸之间的合成和调控相互联系又相互制约[1,2]。
本文报道的TyrR作为一种大肠杆菌芳香族氨基酸合成代谢中的全局性调控蛋白质, 控制着包括自身编码基因tyrR在内,
涉及苯丙氨酸、 酪氨酸、 色氨酸合成与运输的8个转录单元的转录[3,4]。
这些转录单元的共同特征是在其转录调控区内存在着数量为1～3个不等的,
保守结构为TGTAAAN6TTTACA的22 bp茎环结构,
称为TyrR盒[5]。
TyrR蛋白与这些TyrR盒结合实现对8个转录单元的调控。
当有酪氨酸存在时, TyrR蛋白抑制tyrB、
aroP、 aroL-aroM、 aroF-tyrA和tyrP的转录[6]; 体外试验表明这一过程需要ATP参与[7,8]。
TyrR蛋白对aroG和tyrR转录的抑制不需要酪氨酸参与[9,10]。 有苯丙氨酸存在时,
TyrR也可以抑制aroP[11]和tyrB[12]的转录,
对aroG的抑制作用也有增强[5]。 酪氨酸介导的TyrR的抑制作用的机制不同于苯丙氨酸介导的抑制作用, 前者是阻止开放启动子复合物的形成[13], 后者则阻止开放启动子复合物形成以后的下游事件发生[12]。 TyrR蛋白也有激活转录的功能,
受这种激活调控的基因是tyrP和mtr[14,15], 它们编码芳香族氨基酸的跨质膜运输蛋白质。 受TyrR激活的启动子为σ70 启动子,
TyrR 属于I类转录激活因子; 激活作用涉及TyrR与RNA聚合酶的α亚基的相互作用[16～18]。
对TyrR蛋白的研究, 国内尚无相关报道。

本研究运用基因打靶技术,
在大肠杆菌K12的tyrR基因中插入卡那霉素抗性基因(kanR)。 通过双交换同源重组将卡那霉素抗性基因整合在染色体的tyrR基因中[19],
导致tyrR基因正常功能丧失, 实现基因剔除,
与此同时又获得携带卡那霉素抗性基因(kanR)的突变菌株。 我们从基因结构和功能角度对该突变菌株的可靠性加以验证, 对比检测了突变菌株和野生型菌株苯丙氨酸生物合成途径中受TyrR蛋白调控的关键酶活力状况; 研究了剔除tyrR基因对苯丙氨酸生物合成与运输的影响。

1    材料和方法(Materials
and Methods)

1.1   材料

1.1.1       菌株和质粒本研究中使用的菌株和质粒见表1。

Table 1   Strains and plasmids

L,
obtained in this lab; W, obtained from this work.

1.1.2       酶类和主要生化试剂    限制性内切酶、
Taq酶和DNA连接酶购自TaKaRa公司;
酶活力测定试剂购自Sigma公司。

1.1.3       培养基和缓冲液    大肠杆菌培养和质粒增殖培养基 LB、
NB培养基和各抗生素用量参考文献[20]。

基本培养基(MM)： 20 g/L葡萄糖、 5 g/L (NH4)2SO4、
0.5 g/L KH2PO4、 0.5 g/L K2HPO4、 0.5 g/L MgSO4、 5 mg/L MnSO4、 5 mg/L FeSO4; 复合氨基酸(Lys、
Arg、 Met、 Cys、
Cyn、 His、 Gln、
Asp、 Thr各1 mmol/L); 复合维生素(5
mg/L生物素、 20 mg/L烟酰胺、 2 mg/L泛酸钙、
11 mg/L维生素B1、 15 mg/L维生素B2、 0.4 mg/L维生素B6);
过滤除菌。

发酵培养基：
50 g/L葡萄糖、 10 g/L酵母膏、 3 g/L Na2HPO4 、 1 g/L KH2PO₄、 12 g/L NH₄Cl、 1 g/L MgSO₄、 0.3 g/L CaCl₂、 6 g/L柠檬酸钠、
0.6 g/L谷氨酸钠、 2 g/L蛋白胨、 20 mg/L维生素B1,
pH 7.5; 0.07 MPa (10 lbf/in2); 灭菌20 min。

缓冲液X： 7.2 mmol/L K2HPO4、 2.8 mmol/L KH2PO4、 100 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA, pH 7.4。

1.2   方法

1.2.1       DNA抽提和基因工程   操作参考文献[20]的方法完成;
DNA测序由联合基因公司完成。

1.2.2       PCR引物设计       委托上海博亚公司合成, 所使用的引物见表2。

1.2.3       同源重组子的筛选与稳定性测试       pSL4转化E. coli CSH60-31[延长温育时间为3 h, 使用卡那霉素(Kan)单抗LB平板培养],
于转化子中筛选ampS kanR菌落, 进行稳定性测试： 菌种分别接种于LB和含Kan的LB两种液体培养基中连续传代,
120代后, 利用平板菌落计数法比较两种培养物中Kan抗性菌落的数量。 抗生素用量： 氨苄青霉素(Amp)
100 mg/L; Kan 15 mg/L。

1.2.4       LacZ活性的测定   方法参考文献[20]的方法完成。

1.2.5       苯丙氨酸脱氨酶法测定苯丙氨酸含量       参考文献[21]的方法完成。

1.2.6       酶活力测定方法    (1)DHAPS和AT酶活性测定方法参考文献[22～24]的方法完成。

(2)苯丙氨酸吸收(运输)测定NB培养基扩增菌体(含质粒pBP的菌株需添加Amp),  缓冲液X洗涤两次, 取部分菌体测含水量,
另一部分菌体称重后用10 mL 5 mmol/L苯丙氨酸溶液(用缓冲液X配制)悬浮,
37 ℃、 250 r/min摇床培养, 每5
min取样一次, 离心, 取上清液,
利用苯丙氨酸脱氨酶法测定缓冲液中剩余的苯丙氨酸含量, 计算单位干重菌体30 min苯丙氨酸吸收量。

Table 2   Primers used in this study

*
Restriction endonucleases sites are underlined in primers.

2     结果(Results)

2.1   构建同源重组质粒pSL4

根据E.
coli K12 tyrR序列(GenBank No: M12114.1)设计引物, 分两段PCR扩增tyrR编码区：
tyrR 前导区(编码区5′端约600
bp片段)和tyrR尾部(编码区3′端约1200
bp片段)。
将tyrR前导区、 tyrR尾部、
kan2(pJN0上带有kanR基因的DNA片段)和质粒pBR322拼接构成同源重组质粒pSL4(图1)。

Fig.1       Structure of plasmid pSL4

ampR,
ampicillin resistance gene; kanR, kanamycin resistance gene; kan2, DNA sequence
containing kanR.

2.2   筛选tyrR同源重组子

选用基因型为recA+的E. coli CSH60-31作为同源重组的出发菌株, 该菌株具有一定合成苯丙氨酸的能力, 利于检测tyrR基因剔除前后苯丙氨酸生物合成的变化情况。 pSL4转化E. coli CSH60-31后, 质粒上tyrR前导区和tyrR尾部片段将与染色体tyrR基因相应的同源区段发生双交换同源重组, 重组后在大肠杆菌染色体DNA的tyrR基因座位上将出现顺序为“tyrR转录调控区-tyrR
前导区-kan2-tyrR尾部-tyrR下游序列”的DNA序列(图2)。

筛选到的ampS kanR菌落命名为E. coli SL10。
连续传120代后, LB和含Kan的LB培养基中kanR抗性菌落数分别为1.48×1012个/L