(03140)Xu Wen-Lin et al.: Identification of Interation of Neuroglobin and Na+,K+-ATPase beta2

Identification
of Interaction and Interaction Domains between Neuroglobin and Na⁺,
K⁺-ATPase beta2 Subunit

XU Wen-Lin^1,2,
WANG Chun-Li¹, LIAO Zhi-Yong¹, ZHANG Yong-Liang¹,
YU Li-Hong¹, MENG Fan-Wei¹, WANG Xin-Xing²,
YIN Zhao-Yun², QIAN Ling-Jia², ZHANG Cheng-Gang¹

( ¹Beijing Institute of Radiation Medicine,
Beijing 100850, China; ²Institute of Hygiene and Environment
Medicine, Tianjin 300050, China )

Abstract        The
pre-transformed human fetal brain cDNA library was used to screen the protein
interacting with neuroglobin by using yeast two hybrid system III from ClonTech
Inc.. The protein encoded by one of the clones interacting with neuroglobin
(NGB) was confirmed to be the C terminus of the Na⁺, K⁺-ATPase
beta2 subunit (NKA1b2) based on amino acid sequences. Then the full-length
coding region cDNA sequence of NKA1b2 was obtained from human fetal brain cDNA
library by PCR. A set of experiments were designed to test the interaction
between NGB and NKA1b2. Interaction between NGB and NKA1b2 was confirmed by
binding assay in vitro. Furthermore, the interaction was also proved by
co-immunoprecipitation test in vivo. Moreover, the structure integrity of
neuroglobin was found to be essential for the interaction between NGB and
NKA1b2 by yeast two hybrid method with a series of neuroglobin truncated
mutants.

Key words     neuroglobin(NGB);
Na⁺, K⁺-ATPase; yeast two hybrid system; protein
interaction; co-immunoprecipitation

脑红蛋白与Na⁺,K⁺
-ATP酶β2亚基的相互作用及作用位点的鉴定

徐文琳^1,2  王春丽¹   张永亮¹   廖志勇¹   余利红¹   孟凡伟¹   王新兴²   尹昭云²   钱令嘉²      张成岗^１*

（1军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850;2军事医学科学院卫生学与环境医学研究所, 天津 300050 ）

摘要       为研究神经系统特异性携氧蛋白――脑红蛋白(NGB)保护神经元耐受缺氧损伤的分子机制， 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与其有相互作用的蛋白质。 序列分析表明， 其中一个克隆的编码产物与Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基(NKA1b2)序列一致。 随后采用PCR方法从人胎脑cDNA文库中扩增获得NKA1b2全长cDNA。
蛋白质结合实验表明， 原核表达的NGB与体外转录翻译得到的NKA1b2在细胞外有结合作用。 免疫共沉淀实验证明二者在生理条件下能够以复合物的形式存在。
利用NGB系列短截体研究相互作用的位点发现， NGB蛋白N末端1～75位氨基酸可与NKA1b2结合， 但结合力很弱， 而其C末端75个氨基酸则与NKA1b2无结合作用， 由此推测NGB蛋白整体的三维结构是结合所必需的。

关键词   脑红蛋白; Na⁺,K⁺-ATP酶; 酵母双杂交系统; 蛋白质相互作用; 免疫共沉淀

脑红蛋白(neuroglobin， NGB)是新近发现的体内第三类重要的携氧蛋白质， 能够特异性地向脑组织供氧， 在神经系统氧摄取、氧运输和氧利用等生理过程中起重要作用，
预计将在临床脑梗塞、中风等脑缺氧相关疾病的研究及治疗方面具有重要作用［1～4］。
Greenberg等［5］的研究表明， 提高体外培养神经元中NGB的表达量之后， 显著增强细胞抗缺氧的能力；
反义核酸封闭NGB的表达， 则导致细胞对缺氧损伤更为敏感。
这表明缺氧增强NGB的表达， 有助于保护神经元耐受缺氧损伤。
本实验室一直在关注脑缺氧损伤的分子机制， 曾率先获得人脑红蛋白全长cDNA序列［6］和大鼠脑红蛋白基因编码区的cDNA序列［7,8］，
并根据此序列设计引物， 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对大鼠缺氧缺血性脑损伤时脑组织中脑红蛋白mRNA水平的变化进行动态研究， 发现缺氧缺血性脑损伤时脑组织中该基因的表达显著升高， 提示该基因可能在脑缺氧的适应性调节过程中起重要作用［9］。 为了深入探讨这种保护作用的分子机制，
本研究采用酵母双杂交系统， 希望能够筛选到与它相互作用的分子，
为阐明其保护机制提供重要的线索和启示。 本文报道从预转化的人胎脑cDNA文库中筛选到Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基(NKA1b2)与脑红蛋白以复合物的形式存在。
随后克隆了NKA1b2的编码区全长cDNA， 通过细胞外蛋白质结合实验进一步验证二者的相互作用，
免疫共沉淀实验证明二者在生理状态下以复合物形式存在。 这些结果提示NGB有可能通过对Na⁺,K⁺-ATP酶所具有的离子环境内稳态(ion homeostasis)的调节功能发挥神经元保护作用， 从而为NGB所具有的神经保护功能分子机制的阐明提供了重要线索。

1   材料和方法(Materials and
Methods)

1.1 文库、菌株、质粒和试剂

预转化的人20～25周孕龄胎脑cDNA文库、酵母菌株AH109、质粒pGBKT7均购自Clontech公司； pGEX-4T-2载体购自Amersham Pharmacia公司， pGEX-4T-2-NGB由本实验室李林构建； pGEM-T载体购于Promega公司； 大肠杆菌BL21(DE3)为本实验室保存。 所需的限制性内切酶， LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司； 酵母用培养基、酵母转化试剂盒、X-gal均购自Clontech公司； 酸洗玻璃珠购自Sigma公司； TNT体外转录试剂盒购于Promega公司； GST融合表达蛋白纯化树脂谷胱甘肽Sepharose 4B、IPTG和L-［35S］ Met购自Amersham Pharmacia公司； 免疫沉淀试剂盒、蛋白酶抑制剂购自Roche公司； 化学发光底物试剂ECL试剂盒为Santa Cruz公司产品； NGB单克隆抗体和NKA1b2多克隆抗体为本实验室自制。

1.2 质粒构建

本实验室获得的小鼠NGB基因， 利用经PCR引入的SmaI和SalI双酶切位点定向亚克隆至pGBKT7， 形成pGBKT7-NGB； PCR扩增NGB的系列短截体ΔN1-15、ΔN1-40、ΔN1-60、ΔN1-75、ΔC136-151、ΔC111-151、ΔC91-151、ΔC76-151， 利用酶切位点SmaI和SalI亚克隆至pGBKT7， 用于酵母双杂交的验证。 用NKA1b2上游引物pU331：
5′-CATGCAT-GCATGGTCATCCAGAAAGAG-3′(斜体为SphI酶切位点)和下游引物pD332：
5′-ACGCGTCGACTCAG-GTTTTGTTGATGC-3′(斜体为SalI酶切位点)，从人胎脑cDNA文库中扩增NKA1b2编码区全长cDNA(870 bp)， 利用酶切位点SphI和SalI亚克隆至pGEM-T载体； 用上游引物pU331：
5′-CATGCAT-GCATGGTCATCCAGAAAGAG-3′(斜体为SphI酶切位点)和下游引物pD351： 5′-ACGCGTCGACTCA-GATGACCCGGTTC-3′(斜体为SalI酶切位点)，
扩增NKA1b2 N端1～186位氨基酸编码区， 连入pGEM-T载体， 用于体外转录翻译； 用上游引物pT7-Hatag：
5′-AAAATTGTAATACGACTCACATTAG-GGCGAGCCGCCACCATGGCTTACCCATAC-3′和下游引物Ypd：  5′-CACTTGAACGCCCCAAAAAGTCATAGAATGCT-3′， 以筛库获得的质粒pACT2-NKA1b2-C为模板， 扩增NKA1b2的 C端187～290位氨基酸编码区， 获得的PCR产物直接用于体外转录翻译。

1.3 酵母双杂交筛选

采用醋酸锂法将酵母双杂交系统中的重组诱饵载体pGBKT7-NGB转化至酵母菌株AH109， 涂布于SD/-Trp/X-gal、SD/-Trp/-His/X-gal、SD/-Trp/-Ade/X-gal， 鉴定转录激活活性。 与预转化构建于pACT2载体的人胎脑cDNA文库共温育杂交， 涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-gal平板上。
30 ℃培养至菌落长出(7～20天)。
玻璃珠法提取酵母阳性克隆的质粒， 采用电转化法，
将之导入大肠杆菌JM109， 筛选含有插入片段的阳性克隆，
测序分析鉴定。 经生物信息学分析确定插入的基因。

1.4 GST-NGB的诱导表达及纯化

将转化有pGEX-4T-2和pGEX-4T-2-NGB质粒的BL21(DE3)菌株， 经0.1 mmol/L IPTG 30 ℃诱导4 h，
收集菌体， 超声破碎， 收集上清液。 加入谷胱甘肽Sepharose 4B中， 室温下摇床100 r/min温育30 min， 弃上清液， PBS洗去非特异结合的杂蛋白质， 加入还原型谷胱甘肽洗脱液， 室温下摇床100 r/min温育20 min， 取上清液，
获得纯化的GST和GST-NGB。
1.5 细胞外蛋白质结合实验［10］

分别取500 μl GST和GST-NGB原核表达上清液， 加入50 μl柱床体积的谷胱甘肽Sepharose 4B中， 洗去未结合的蛋白质， 加入体外转录翻译得到的1～10 μl 35S标记的NKA1b2全长、N端和C端各片段， 4 ℃过夜。 洗去未结合的蛋白质， 加入6×SDS上样缓冲液， 99 ℃变性7 min， 使复合物解离。 取解离上清液进行浓度为12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，
干胶， 压X光片， -80 ℃曝光， 显影。

1.6 免疫共沉淀

取一只出生3天乳鼠大脑皮层， 加1 ml细胞裂解液，
匀浆处理， 4 ℃轻摇1 h， 12 000 r/min离心10 min， 取上清液加入对照IgG， 20 μl 蛋白A琼脂糖， 4 ℃摇1 h， 12 000 r/min离心20 s，
取上清液加入NKA1b2多抗， 4 ℃摇1 h，
加50 μl蛋白A琼脂糖， 4 ℃摇过夜， 12 000 r/min离心20 s，
沉淀用细胞裂解液重复洗4次， 加20 μl 2×SDS上样缓冲液， 99 ℃变性7 min。 进行浓度为12.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 转移至PVDF膜上， 4 ℃封闭过夜， 用NGB单抗检测免疫沉淀复合物中是否存在NGB。

1.7 相互作用位点的鉴定

将构建于pGBKT7的NGB及系列缺失短截体的重组载体， 分别与pACT2-NKA1b2重组载体， 采用醋酸锂法共转化至酵母菌株AH109， 涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/ X-gal平板上， 30 ℃培养至菌落长出(7～20天)， 以确定有无相互作用。

2 结果(Results)

2.1 酵母双杂交筛选及鉴定

重组质粒pGBKT7-NGB转化酵母菌株AH109， 涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade平板， 并检测β-半乳糖苷酶活性，
结果表明NGB在该酵母系统中无转录激活活性， 可作为诱饵蛋白质利用酵母双杂交系统筛选文库。
经过筛选， 得到58个阳性克隆， 采用玻璃珠法提取酵母质粒，
电转化至大肠杆菌JM109， 测序鉴定插入片段。 采用自编的读码框分析程序(ORF finder)分析测序结果， 并使用ClustalW程序进行蛋白质同源序列比对分析。
结果发现， 编号为jky2167的克隆所编码的氨基酸序列与人Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基(NKA1b2)的187～290位氨基酸一致(图1)。

Fig.1       Diagram
shows the amino acid sequence encoded by the clone jky2167 is fully identified
with C-terminal of human Na⁺，K⁺-ATPase β2 subunit

Fig.2
     GST-NGB interacts
with NKA1b2 in vitro

(A) SDS-PAGE analysis of GST-NGB fusion protein
and GST expressed in E. coli BL21(DE3).1, mid-range protein molecular weight
marker; 2, total protein of E. coli BL21(DE3) transformed by control vector
pGEX-4T-2; 3, purified GST protein; 4, total protein of E. coli BL21(DE3)
transformed by pGEX-4T-2-NGB; 5, purified GST-NGB fusion protein. (B) SDS-PAGE
and autoradiography represents that NGB binds NKA1b2 and NKA1b2 187－290 aa, does not bind NKA1b2 1－186 aa in vitro. 1, 2, 3, the
protein NKA1b2 1－186 aa, full
length, and 187－290 aa
translated in vitro; 4, GST-NGB can not pull down NKA1b2 1－186 aa; 5, GST-NGB pull down NKA1b2
full length; 6, GST-NGB pull down NKA1b2 187－290 aa; 7, GST can not pull down NKA1b2 full length.

2.2 NGB与NKA1b2在细胞外存在相互作用

按前述方法进行GST和GST-NGB的诱导表达。 GST主要在上清液中表达， 而GST-NGB则主要以包涵体的形式存在，
但也有20%左右的蛋白质在上清液中表达，
纯化后其含量足以满足细胞外蛋白质结合实验的需要。 取表达的可溶上清液，
结合至50 μl柱床体积的谷胱甘肽Sepharose 4B， 分别加入体外转录翻译获得的NKA1b2全长、NKA1b2 N端(1～186位氨基酸)、C端(187～290位氨基酸)1～10 μl， 进行蛋白质结合实验，
结果见图2。
实验结果进一步证明GST-NGB在细胞外可与NKA1b2的C端187～290位氨基酸结合， 与NKA1b2的全长也可以结合， 与N端1～186位氨基酸却没有作用。 阴性 对照的GST与NKA1b2全长不能结合， 从而证明NGB在细胞外可结合NKA1b2。

2.3 NGB与NKA1b2在生理条件下存在相互作用

为了确定NGB与NKA1b2在生理条件下是否有相互作用， 取一只出生3天乳鼠大脑皮层进行组织匀浆。 用NKA1b2多抗进行免疫沉淀， 正常IgG做阴性对照， NGB单抗进行Western 印迹， 检测到NGB的存在， 证明在生理条件下NGB与NKA1b2以复合物的形式存在（图3）。

Fig.3
     Endogenous NGB
interacts NKA1b2 in vivo

Endogenous NGB-NKA1b2 complex were
immunoprecipitated from tissue lysate of human fetal brain with anti-NKA1b2
antibody and NGB was detected by immunoblotting with anti-NGB antibody.
Precipitation with rabbit normal IgG served as controls.

2.4 NGB与NKA1b2相互作用位点的鉴定

分别将NGB的系列短截体ΔN1-15、ΔN1-40、ΔN1-60、ΔN1-75、ΔC136-151、ΔC111-151、ΔC91-151、ΔC76-151连入pGBKT7， 与pACT2-NKA1b2共转化至酵母菌株AH109， 涂布于四缺培养基，
观察相互作用情况， 结果见图4。 该结果提示， NGB整体的三维结构是结合所必需的， N端1～75位氨基酸也可以与NKA1b2结合， 但结合力很弱， C端75个氨基酸则不能与NKA1b2结合。

Fig.4
     Interaction
between NGB truncated mutants and NKA1b2

3 讨论(Discussion)

缺氧缺血性脑损伤一直是临床上难以解决的问题，
这主要是因为损伤过程中存在多种病理机制交互作用。 在诸多损伤因素中，
脑细胞能量衰竭被认为是首先发生的重要环节。 缺氧缺血首先导致能量代谢发生障碍， ATP耗竭， 细胞膜上的Na⁺,K⁺-ATP酶失去其正常功能，
从而使细胞外K＋浓度增加， 细胞内Na＋、Cl－堆积， 细胞膜去极化， 电压依赖性钙通道开放， 导致Ca2+大量进入胞内， 维持细胞正常生命活动的离子内稳态被破坏。
而且这种去极化， 会使得谷氨酸类兴奋性神经递质从突触前囊泡大量释放进入突触间隙，
持续作用于NMDA和非NMDA受体，
进一步使Na⁺和Ca2+大量进入胞内，
形成钙超载。 尽管由于钙离子在细胞信号转导和细胞代谢过程中发挥重要作用，
钙超载被认为是导致神经细胞死亡的中心环节， 但也正是由于离子自稳态的失衡诱发了钙超载，
因此， 如果在缺氧早期纠正离子自稳态失衡，
可一定程度上缓解细胞损伤。 De Angelis等［11］证实低氧可诱发内源性Na⁺,K⁺-ATP酶抑制剂释放，
从而抑制Na⁺,K⁺-ATP酶的活动。 在缺氧环境下， Na⁺,K⁺-ATP酶活性降低，
一方面能将其节省的ATP用于维持其自身的功能活动， 稳定跨膜的离子浓度梯度， 另一方面又可将节省的ATP用于其他细胞内环境稳定过程， 这是脑组织对低氧的一种生理性适应。

长期以来，
缺氧缺血性脑损伤的研究大多集中在氧利用的下游事件， 如缺氧缺血后造成的生理改变等，
人们始终不知道在脑内是否存在特异的携氧蛋白质能够促进脑内的氧利用。 脑红蛋白这一对脑内氧转运和氧储存起重要作用分子的发现， 为脑缺氧研究提供了全新的方向。
其中最为引起关注的是Greenberg等［5］采用原代培养的细胞证明， NGB能够保护神经元免受缺氧导致的损伤。 Venis［3］对此项工作予以高度评价， 认为将为脑中风等神经系统退行性疾病的治疗带来曙光。
最近， Greenberg等［4］又证明了NGB在体内能保护大脑防止中风。 然而， 脑红蛋白是怎样保护神经元免受缺氧性损伤的，
即脑红蛋白的作用机制如何？这一问题却一直未得到回答。

为了探讨脑红蛋白保护神经元耐受缺氧的分子机制，
我们在前期工作的基础上， 利用酵母双杂交系统， 以NGB为诱饵蛋白质从预转化的人胎脑cDNA文库中筛选到Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基与其有相互作用。
细胞外蛋白质结合实验证明， NGB通过与NKA1b2的C末端结合形成复合物。
免疫共沉淀实验检测到二者在脑组织匀浆中以复合物形式存在， 证明二者在生理条件下确实有相互作用。
最近， Schmidt 等人［12］以视网膜作为模型研究NGB的表达时发现， NGB定位于高耗氧的丛状层和外核层， 而Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基在视网膜中也同样定位于外核层和突触末梢［13］， 这在一定程度上也支持了我们的结论。

本实验中以NGB为诱饵蛋白质筛选到的Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基是β亚基的一个亚型， 在脑、视网膜等神经组织中特异性表达。 Na⁺,K⁺-ATP酶是由α、β和γ亚基组成， 其中β亚基的主要功能是作为调节亚基， 协助新合成的α亚基正确折叠， 定位于膜上， 装配形成有功能的Na⁺,K⁺-ATP酶［14］。
此外， 还推测它可能与内源性K⁺的转运有关。 本文研究证实NGB与Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基在体内以复合体的形式存在，
尚需进一步探讨该复合体是否能够直接调节Na⁺,K⁺-ATP酶的活性， 或是通过影响Na⁺,K⁺-ATP酶在膜上的定位间接调节其活性，
从而在脑缺氧缺血过程中调节细胞的离子自稳态， 保护神经元耐受缺氧损伤。
同时已知， Na⁺,K⁺-ATP酶β2亚基作为Ca2＋依赖的神经胶质细胞粘附分子， 参与神经元与神经胶质细胞之间的作用［15］。 β2亚基基因剔除的小鼠出现神经元退化的症状［16］，