(03158)You De-Lin et al.: Hypoxanthine-guanine Phosphoriboysltransferase Mutants from T. tengcongensis

Cloning,
Expression and Characterization of the Hypoxanthine-guanine
Phosphoribosyltransferase Mutants from T. tengcongensis

YOU De-Lin, QU Hong, CHEN
Qiang, XING Yang, GU Xiao-Cheng, LUO Ming¹

(
State Key Laboratory of Protein Engineering and Plant Genetic Engineering,
College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China; ¹Department
of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama
35294, USA )

Abstract        Based
on a predicted three-dimensional structure of hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase (HGPRT) from Thermoanaerobacter tengcongensis, three
mutants of HGPRT were designed to modify the purine specificity of HGPRT.
Site-directed mutagenesis was used to generate the three mutants, K133A, K133S,
K133T. Wild type HGPRT and its mutants were expressed E. coli in BL21 (DE3)
pLysS, and the expression products of them reached about 30% of the total
protein. The molecular weight of the recombinant proteins was 22 kD. The
specific activities of the enzymes were determined. Catalytic activities of
mutants K133A, K133S, K133T retained only 4%, 1.1%, 2.7% activities,
respectively, of the wild type for hypoxanthine, 1.7%、 0.6%、 1% activities, respectively, of
wild type for guanine. However, the three mutants showed 24-fold, 7-fold,
18-fold activities, respectively, of the wild type for xanthine, and 650-fold,
210-fold, 380-fold activities, respectively, of the wild type for adenine.
Comparison of kinetic data for purified recombinant mutant with wild-type HGPRT
showed significant difference in the catalytic efficiency (kcat/Km) for purine,
xanthine and adenine, the mutants exhibiting more than 40 to 50-fold higher
kcat/Km, as a result of nearly 4 to 5-fold decrease in Km, compared with wild-type.
These results demonstrate that a single amino acid substitution in HGPRT at the
active site can significantly modify the specificity for binding purine.

Key words     hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase mutant; riboside analog; site-directed mutagenesis

次黄嘌呤–鸟嘌呤磷酸核糖转移酶突变体的基因构建、表达和性质

由德林 曲红 陈强 邢阳 顾孝诚 罗明1*

（ 北京大学生命科学学院、 蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室， 北京 100871； 1阿拉巴马大学伯明翰分校微生物学系， 阿拉巴马， 伯明翰 35294 ）

摘要       通过对我国嗜热菌Thermoanaerobacter tengcongensis中次黄嘌呤–鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)三维结构进行同源模建， 设计出HGPRT的突变体K133A、 K133S和K133T。
用抗性筛选法， 对HGPRT的基因进行了定点突变， 并实现了在大肠杆菌中的高效表达。 野生型HGPRT及其突变体K133A、 K133S和K133T的催化动力学研究表明， HGPRT突变体改变并扩大了底物专一性， 具有催化嘌呤类似物的活性。

关键词   次黄嘌呤–鸟嘌呤磷酸核糖转移酶； 核苷类似物； 定点突变

目前，
在抗病毒领域取得的大多数成就都是来自核苷类似物， 核苷类药物占抗病毒药物的约一半以上，
但它们还存在许多缺陷： 如生物利用度低、 溶解度小、 在体内迅速失效及潜在致畸等副作用，
这些都需要改进［1， 2］。
核苷类药物的制备一般采用化学合成的方法， 其缺点是步骤多、
难度高、 周期长且有异构体产生， 往往需要先对碱基或核糖基团进行保护， 此后还要去除保护基团，
使合成的反应总收率降低。 因此除了研究新的化学合成方法外，
还需要建立其他更快、 更有效的方法来合成新的核苷类似物。
并且期望从这些核苷类似物中获得高效低毒的抗病毒和抗肿瘤药物。

次黄嘌呤–鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）（E.C. 2.4.2.8）催化5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）与次黄嘌呤或鸟嘌呤产生嘌呤核苷及无机焦磷酸的反应。 HGPRT是嘌呤补救途径中的一个关键酶， 生物体内除能以简单的前体物质“从头合成” (de novo synthesis)核苷酸外， 也能由预先形成的嘌呤碱基合成核苷酸，
从而对核苷酸代谢起到一种“补救”(salvage)作用［3］。
目前国际上对HGPRT开展了许多结构与功能的研究， 人的HGPRT和寄生虫如大肠杆菌、 锥体虫、 疟原虫的HGPRT的晶体结构均已经得到解析， 并被收录到PDB库中［4～6］。 这些HGPRT由3或4个α螺旋包裹4或5个平行β折叠构成。 不同物种的HGPRT的活性中心有高度同源性， 并且有研究表明， 单个氨基酸的取代就改变了HGPRT的底物特异性［7］。

我们选用得自嗜热性细菌Thermoanaerobacter tengcongensis的HGPRT， 对其三维结构进行同源模建，
找出HGPRT与底物相互作用的位点， 然后通过定点突变技术来改变和扩大底物的专一性，
使其能够接受嘌呤及磷酸核糖焦磷酸的类似物作为底物， 从而合成多种核苷类似物。
由于我们选择的原始菌株由我国科学家在云南腾冲温泉中发现， 所得突变体不仅具有独特酶学性能，
而且具有很好的热稳定性。 采用酶促合成的方法， 可以弥补化学合成的不足， 从而获得更多的核苷类似物，
为开发高效低毒的抗病毒药物做准备， 具有潜在的应用价值。

 

1   材料和方法(Materials and
Methods)

1.1 材料

1.1.1       试剂 T4 DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶、 限制性内切酶购自大连宝生物公司；
GeneEditorTM in vitro Site-directed Mutagenesis System、 Wi-zard�q Plus Minipreps DNA
Purification System为Promega公司产品； HiTrapNi-columns、 Superdex-75 HR 16/60为Pharmacia产品； PCR引物由上海生物工程公司合成； 鸟嘌呤、 黄嘌呤、 5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)、 次黄嘌呤、 2, 6-二巯基嘌呤、 6-羟基-2-甲氨基嘌呤为Sigma产品； 2-溴次黄嘌呤、 甲氧基鸟嘌呤、 2, 6-二氨基嘌呤为Aldrich 公司产品； 其他试剂均为国产分析纯。 HGPRT的cDNA克隆和高效表达菌均由本室制备， 另文发表。

1.1.2      菌株与质粒 大肠杆菌菌株DH5α、 BL21 (DE3)
pLysS及质粒pET15b均为本研究室保存。

1.2 方法

1.2.1      计算机同源模建        采用WU-Blast2序列搜索程序对PDB数据库进行与HGPRT同源的序列比对。 采用MSI公司的Homology模块软件， 以1HGX的晶体结构为模板， 同源模建了HGPRT的三维结构。 对模建的HGPRT三维结构， 采用最陡下降法、
共轭梯度法和va09a法， 在CVFF力场上进行1000步的分子力学优化， 获得低能量的构象。

1.2.2      HGPRT基因的PCR扩增及重组质粒构建    以本室构建重组质粒pET11a-HGPRT为模板， PCR扩增HGPRT基因， 5′端引物为： 5′-GGAATTCCATATGCCAAGTCCTATGGAAG-3′， 3′端引物为5′-
CGCGGATCCTCATTTATAAAGCTCTGGCT -3′， 5′端和3′端分别引入NdeI和BamHI位点，
斜体字母表示酶切位点。 PCR扩增程序为： 50 μl反应体系， 94 ℃ 5 min， 以94 ℃ 1 min， 55 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min反应30个循环后， 72 ℃延伸10 min。 DNA片段的回收、
酶切、 纯化、 与载体pET15b的连接、 转化等操作参见《分子克隆实验指南》。
质粒的抽提按试剂盒说明书操作。

1.2.3      HGPRT突变体基因的构建       在构建的重组质粒pET15b-HGPRT上， 使用Promega公司GeneEditorTM in vitro Site-directed Mutagenesis System试剂盒， 按其说明书方法进行突变基因的构建。
引物序列如下： K133A的引物，
5′-TTGCACGATTTTA-GATGCACCTGAAAGAAGAGAGGC-3′； K133S的引物，
5′-TTGCACGATTTTAGATTCCCCTGAAAGAAG-AGAGGCAG-3′； K133T的引物，
5′-TTGCACGATTTTAGATACTCCTGAAAGAAGAGAGGC-3′。
其中， 黑体字母表示突变位点。

1.2.4      野生型HGPRT及其突变体的表达和纯化     将重组质粒pET15b-HGPRT及其突变体转化E.coli BL21 (DE3) pLysS， 筛选的阳性克隆接种于适当体积的LB培养基中， 37 ℃过夜培养。 取过夜培养物按1∶20接种于新鲜含有氨苄青霉素
100 mg/L 、 氯霉素 34 mg/L的 LB培养基中， 37 ℃培养至菌液A590在0.6～0.8左右时， 向培养基中加入IPTG使终浓度为0.5
mmol/L， 继续培养5 h， 离心收集菌体，
用15% SDS-PAGE鉴定。 收集诱导表达的菌体， 经超声破碎细菌后， 于4 ℃、 16 000 r/min离心50 min， 取上清液上样于预先用开始缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、 0.3 mol/L NaCl）平衡的HiTrap Ni-columns， 再用洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、 0.3 mol/L NaCl、 100 mmol/L 咪唑）洗涤, 最后用洗脱缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、 0.3 mol/L NaCl、 500 mmol/L咪唑）洗脱， 洗脱样品用Centricon Plus-20 (PL-10) 离心超滤，
浓缩至2 mL 后， 上样于用20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、 0.15 mol/L NaCl平衡的Superdex-75 HR 16/60， 流速1 ml/min， 以上操作均在�FKTA FPLC上进行。 收集各组分并用15% SDS-PAGE鉴定。

1.2.5      HGPRT活性和动力学常数测定      参照文献［8］的方法，
反应总体系0.5 ml， 在100 μmol/L 嘌呤（测定鸟嘌呤时， 浓度为50 μmol/L）， 1 mmol/L PRPP， 100 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、 12 mmol/L MgCl2缓冲液中， 加入HGPRT， 37 ℃下， 对于次黄嘌呤、 鸟嘌呤、 黄嘌呤、 腺嘌呤分别在245、 257、 255、 260 nm于Pharmacia Biotech Ultrospec 2000分光光度计上测定光吸收增加。 相应Δε分别为 1900
(mol/L)^－1・cm^－1 (次黄嘌呤-IMP)， 5900 (mol/L)^－1・cm^－1 (鸟嘌呤-GMP)， 3794 (mol/L)^－1・cm^－1 (黄嘌呤-XMP)， 1600 (mol/L)^－1・cm^－1 (腺嘌呤-AMP)。 2, 6-二巯基嘌呤、 6-羟基-2-甲氨基嘌呤、 2-溴次黄嘌呤、 甲氧基鸟嘌呤、 2, 6-二氨基嘌呤分别在257、 235、 235、 257、 245nm测定。 在固定1 mmol/L PRPP， 改变嘌呤底物浓度范围为5～100 μmol/L 的条件下， 测定反应的初速度， 并计算获得相应的动力学常数Km和kcat。

1.2.6      蛋白质浓度测定  按Bradford法［9］测定， 以牛血清白蛋白为标准。

2 结果(Results)

2.1 HGPRT三维结构的同源模建

采用WU-Blast2序列搜索程序搜索PDB数据库， 选取与HGPRT序列同源性较高的1HGX为模板蛋白质(序列同源性为45.5%)［10］，
序列比对结果如图1。

Fig.1
Comparison of amino acid sequence of HGPRT from T. tengcongensis with
other known structure determined HGPRTs

同源模建了HGPRT的三维结构如图2、 图3。

Fig.2 Conserved residues at the active site of Tritrichomonas foetus HGPRT complex with ligands

Fig.3 Homology modeling of HGPRT from T. tengcongensis Pink, 3-D structure of 1HGX complex with ligands; Blue, 3-D structure of HGPRT.

2.2 HGPRT基因的PCR扩增及重组质粒构建

以pET11a-HGPRT为模板PCR扩增的HGPRT基因为540 bp左右， 结果见图4。 通过DNA片段的回收、 酶切、
纯化、 与载体pET15b的连接， 构建成重组质粒pET15b-HGPRT。 序列分析表明与克隆基因一致， 并且在HGPRT前， 即表达HGPRT的N末端为(His)6， 便于重组蛋白质的纯化。

Fig.4
     Agarose gel electrophoresis
of HGPRT gene PCR products

1,
marker; 2, 3, PCR product of HGPRT gene.

2.3 突变体K133A、 K133S和K133T表达质粒构建

以构建的重组质粒pET15b-HGPRT为模板， 使用Promega公司GeneEditorTM in vitro
Site-directed Mutagenesis System试剂盒， 通过两次转化获得的阳性克隆经DNA序列测定后， 其结果与预期的一致（结果未示）。

2.4 野生型HGPRT和突变体K133A、 K133S、 K133T的表达及分离纯化

SDS-PAGE表明， 表达的HGPRT为22 kD， 占菌体总蛋白质的30%左右。
pET15b-HGPRT的表达产物经HiTrap
Ni-columns纯化， 利用Superdex-75 HR 16/60进一步纯化， 得到电泳单一条带HGPRT， 见图5(A)。 突变体K133A、 K133S、 K133T的纯化结果见图5(B)。

Fig.5      Comparison of the efficiency of
each purification step

(A) 1, total bacteria protein before
induction; 2, total bacteria lysate; 3, soluble fraction of lysate; 4, purified
through HiTrap Ni-columns; 5, 6, 7, purified through Superdex-75; (B) 1,
purified mutant K133A; 2, purified mutant K133T; 3, purified mutant K133S.

2.5 HGPRT活性

以纯化的野生型HGPRT和突变体K133A、 K133S、 K133T为材料， 测定其对次黄嘌呤、 鸟嘌呤的生物活性， 结果见表1。 3个突变体的活性均低于野生型HGPRT。 K133A、 K133S、 K133T对次黄嘌呤的活性分别是野生型HGPRT的4%、 1.1%、 2.7%， 对鸟黄嘌呤的活性分别是野生型HGPRT的1.7%、 0.6%、 1%。 而突变体K133A、 K133S、 K133T与野生型HGPRT相比， 显示出催化黄嘌呤和腺嘌呤和一些嘌呤类似物的活性。
3个突变体对黄嘌呤的活性分别是野生型HGPRT的24、 7、 18倍， 对腺嘌呤的活性分别是野生型HGPRT的650、 210、 380倍。

Table
1   The activity（μmol・min^－1・mg^－1）of wild type(WT) HGPRT and mutants
for purine analogs

*Units
of activity are defined as increase of absorbency per min (A min^－1・mg^－1).

固定一个底物PRPP的浓度， 改变另一个底物嘌呤的浓度，
测定反应初速度， 并求得Km和kcat， 见表2。 结果显示，
突变体K133A、 K133S、 K133T对次黄嘌呤、 鸟嘌呤的表观Km值大于野生型HGPRT， 而对黄嘌呤和腺嘌呤的表观Km值小于野生型HGPRT。 这一结果与活性的结果是相符的。
进一步计算求得催化特异常数kcat/Km列于表2中。

Table 2   Kinetic parameters of wild type(WT) HGPRT
and mutants

3 讨论(Discussion)

以1HGX的晶体结构为模板， 同源模拟了HGPRT的三维结构。 HGPRT的序列与已知结构的模板蛋白质1HGX的序列同源性为45.5%。 从模板蛋白质1HGX复合物结构分析得知， 复合物5GP与活性位点上的103位Asp、 107位Thr、 110位Thr、 134位Lys和157位Ile形成较强的氢键， 其中134位Lys与嘌呤环6-位上的基团(OH-)有氢键作用（如图2）， 相应HGPRT的133位也是一个Lys， 并且有研究表明， 来自Tritrichomonas foetus的HGPRT的相同位置的Lys突变为Ser后， 扩大了底物特异性， 表现出较高的催化腺嘌呤的活性［11］。 根据这些数据我们设计两个突变体K133T、 K133S。 由于嘌呤类似物2, 6-二巯基嘌呤、 6-羟基-2-甲氨基嘌呤、 2-溴次黄嘌呤、 甲氧基鸟嘌呤和2, 6-二氨基嘌呤都是在6-位、 2-位增加一些修饰基团，
而Lys侧链基团相对较大，
考虑到空间效应可能影响到嘌呤类似物的结合， 设计了一个HGPRT突变体K133A， 并可以检验HGPRT的133位Lys对保持底物特异性方面的作用。

野生型HGPRT和突变体K133A、 K133S、 K133T活性分析结果显示， 3个突变体对次黄嘌呤和鸟黄嘌呤的活性均低于野生型HGPRT， 下降了约两个数量级。 而对黄嘌呤和腺嘌呤活性大于野生型HGPRT， 对黄嘌呤的活性增加了约两个数量级，
对腺嘌呤的活性增加了约3个数量级。 这些结果表明， HGPRT的133位Lys对维持底物特异性起关键作用， 3个突变体中活性变化最大的是K133A， Ala是一个最没有个性的氨基酸，
但在3个突变体中催化活性最大，
提示Lys的侧链较大，
改变了HGPRT 活性部位空间大小， 从而影响了嘌呤类似物的结合。

表达的HGPRT和其突变体均达到菌体总蛋白质的30%以上， 突变体的表达产物和经HiTrapNi-columns纯化的蛋白质在SDS-PAGE中的表观分子量均与野生型HGPRT相似， 说明其结构并无显著改变（结果未示）。

酶动力学研究表明，
突变体K133A、 K133S、 K133T对次黄嘌呤、 鸟嘌呤的表观Km值比野生型HGPRT的大， 即对次黄嘌呤、 鸟嘌呤的亲和力降低； 而对黄嘌呤和腺嘌呤的表观Km值则比野生型HGPRT小， 即对黄嘌呤和腺嘌呤的亲和力增加，
这一结果与酶活性分析结果是一致的。 野生型HGPRT， 对底物次黄嘌呤、
鸟嘌呤的催化特异常数kcat/Km是对黄嘌呤和腺嘌呤的1.4×10⁴～4.3×10⁴倍， 表明次黄嘌呤和鸟嘌呤是野生型HGPRT专一性底物。 突变体K133A、 K133S、 K133T对底物次黄嘌呤、 鸟嘌呤的催化特异常数kcat/Km只有野生型HGPRT的0.1%～1%，
但对黄嘌呤和腺嘌呤的催化特异常数kcat/Km是野生型HGPRT的40～50倍。 而且3个突变体对次黄嘌呤、 鸟嘌呤、 黄嘌呤和腺嘌呤的催化特异常数kcat/Km没有明显的差异， 最大的只相差一个数量级， 表明突变体改变了对嘌呤底物的催化特异性。

目前, 我们正在进行突变体晶体结构的研究， 通过突变体晶体结构的解析， 一方面可以检验这种活性部位的大小对嘌呤底物特异性的影响，
另一方面也可以指导我们设计新的突变体， 从而获得催化嘌呤和PRPP类似物的高活性HGPRT突变体。

感谢北京华大基因研究中心提供基因组DNA， 并感谢本实验室安建立博士、
郑晓峰博士、 苏晓东博士给予的大力支持和帮助。

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Received: May 13, 2003        Accepted:
June 3, 2003

This work was supported by grants from the
National High Technology Research and Development Program of China (863
Program) (No. 2001AA231011-02) and the National Natural Science Foundation of
China (No. 30140420812)

*Corresponding author: Tel, 86-10-62759624;
e-mail, [email protected]