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https://www.abbs.info ISSN 0582-9879 |
The Effect of Anti-bcr-abl Hammerhead Ribozyme on Bone Marrow
Purging
WU
Yong, CHEN Yuan-Zhong*, HUANG Hui-Fang, CHEN Ping, LU Lian-Huang
(Fujian Institute of Hematology, Union Hospital, Fujian Medical
University, Fuzhou 350001, China)
Abstract To
study effects of a hammerhead ribozyme on chronic myelogenous leukemia (CML)
cells and bone marrow purging in vitro, a bcr-abl specific ribozyme gene was
introduced into CML and normal bone marrow cells using retroviral transduction.
The effects of the ribozyme on primary cells from CML patients were detected by
hematopoietic progenitor cell assays, flow cytometry and immunocytochemical
methods. Then a model of remission was built up, and the effects of ribozyme on
bone marrow purging were detected by leukemia colony assay and nest-PCR after
transduction of this model by using the ribozyme. The results showed that
ribozyme significantly suppressed the clonogenic growth and the expression of
p210 protein in primary cells from CML patients, but did not affect the growth
of normal hematopoietic progenitor cells. In the model of remission, ribozyme
eliminated the proliferation and the expression of bcr-abl mRNA in residual K562
cells, but did not affect the expression of abl mRNA. The results suggest that
Anti-bcr-abl ribozyme might be used for bone marrow puring of CML cells.
Key words hammerhead
ribozyme; fusion gene; bcr/abl ; chronic myelogenous leukemia; bone marrow
purging
针对bcr/abl的锤头状核酶的骨髓净化作用
吴勇 陈元仲* 黄慧芳 陈萍 吕联煌
( 福建医科大学协和医院， 福建省血液研究所， 福州 350001 )
摘要 为了探讨锤头状核酶对原代慢性粒细胞白血病(chronic
myelogenous leukemia，CML)细胞的作用及其在体外骨髓净化的效果， 应用逆转录病毒介导的基因转移法将针对bcr/abl融合基因的核酶转染原代CML和正常人骨髓单个核细胞，通过造血祖细胞集落培养、流式细胞术、免疫细胞化学法检测核酶对原代 CML细胞的作用；进一步将此核酶转染CML缓解模型，通过白血病细胞集落培养、巢式RT-PCR检测其在体外骨髓净化的效果。结果表明，原代 CML细胞生长增殖和p210的表达显著受抑，但正常造血祖细胞受影响较小；核酶完全抑制模拟缓解骨髓中残留K562细胞的增殖及bcr/abl
mRNA表达，但并不影响abl
mRNA表达，因此有望用于CML的体外骨髓净化。
关键词 锤头状核酶；
融合基因； bcr/abl； 慢性粒细胞白血病； 骨髓净化
自体骨髓移植已成功地用于治疗慢性粒细胞白血病（chronic
myelogenous leukemia， CML）， 但移植物中常残留费城染色体（Ph）阳性的细胞， 如何清除自身移植物中少数白血病细胞一直是个难题。 bcr/abl融合基因在CML发病中起重要作用， 利用核酶技术进行基因干预为此提供了手段。 核酶是一类在序列特异性识别基础上对靶RNA具有催化切割活性的RNA分子， 已在癌症靶向基因治疗中得到广泛应用［1～5］。 新近研究表明针对bcr/abl mRNA的核酶转染CML的骨髓细胞导致bcr/abl mRNA表达水平显著下降， 其有可能用于CML的骨髓净化［6］。 我们前期研究将针对bcr/abl融合基因B3/A2的锤头状核酶转染CML细胞株K562细胞， 发现其bcr/abl
mRNA及p210表达水平下降， 细胞生长增殖受抑制， 并发生凋亡［7］。 本研究应用逆转录病毒载体介导的基因转染法， 观察该核酶对原代CML细胞的作用及其在体外骨髓净化的效果。
1 材料和方法(Materials and
Methods)
1.1 材料
1.1.1 质粒 逆转录病毒载体pLXSN由美国Squibb药物研究所陈列平教授惠赠， 逆转录病毒载体pLRZSN包含针对bcr/abl融合基因B3/A2的锤头状核酶cDNA序列， 如图1所示。 质粒pLRZSN由本所构建， 参见文献［7］。
Fig.1 Sequence and
biochemical properties of hammerhead ribozyme cleaving the bcr/abl Mrna
1.1.2 病例 慢性粒细胞白血病8例， 均为Ph染色体阳性、 bcr/abl融合基因为B3/A2的慢性期患者， 正常供髓者5例。 所有病例及正常对照均来自福建医科大学协和医院血液科门诊及住院病人。
1.1.3 细胞株 PA317和NIH3T3细胞均来自北京医科大学， K562细胞由中国科学院生物化学与细胞生物学研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒上清的制备及滴度测定 按常规方法进行［8］， 用脂质体介导的基因转移技术分别将pLXSN、 pLRZSN转染包装细胞PA317， 脂质体LipofectinTM为 Life Technology公司产品。 以含600 mg/L G418的DMEM培养液选择培养至抗性克隆形成，
分别为PA317/pLXSN、 PA317/pLRZSN。 分别挑取数个克隆用NIH/3T3细胞进行滴度测定， 病毒上清液稀释后转染NIH/3T3细胞， 用含G418的DMEM培养液筛选抗性克隆， 病毒滴度=抗性克隆数×病毒稀释倍数/病毒上清液体积。 筛选高滴度的病毒上清液， 250 g离心5 min， 去除细胞碎片， 分装小份， 置－70 ℃冻存备用。
1.2.2 骨髓细胞培养 3.8%枸橼酸钠抗凝的骨髓标本， 用淋巴细胞分离液按常规方法分离单个核细胞计数，
重悬于含10% 马血清及10% 胎牛血清， 5×10－7
mol/L氢化可的松的IMDM培养液中， 置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱培养。
1.2.3 核酶基因转染骨髓细胞 逆转录病毒介导的核酶基因转染骨髓细胞方法参照文献［9］进行， 上述骨髓细胞培养体系中加细胞因子(100 μg/L IL-3、 50 μg/L GM-CSF、 200 μg/L SCF)温育48 h后， 转移至纤连蛋白(5 μg/cm2)包被的24孔培养板（Costar）中， 加pLRZSN病毒上清液及终浓度4
mg/L Polybrene混匀后， 置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养， 同时以pLXSN病毒上清液作为对照。 24 h后重复转染1次，
继续培养48 h， 进行造血祖细胞集落培养。
1.2.4 流式细胞仪检测p210表达 核酶基因转染前后慢性粒细胞白血病细胞用PBS洗涤后， 先用IntraprepTM渗透试剂（coulter公司）预处理， 然后加入鼠抗人Bcr单克隆抗体(Santa Cruz公司)温育后，
再加入等量的FITC标记的兔抗鼠IgG， 然后在FACscan型流式细胞仪（美国BD公司）检测p210表达率， 同时以 FITC 标记鼠抗人IgG作为阴性对照。
1.2.5 免疫组化检测p210表达 核酶基因转染前后慢性粒细胞白血病细胞用PBS洗后， 涂于预先用L-多聚赖氨酸处理过的载玻片， 自然晾干， 冷丙酮固定。 染色方法按链霉素抗生物素蛋白–过氧化物酶免疫化学染色试剂盒（Maxin公司）说明书进行。 一抗为鼠抗人Bcr单克隆抗体， 同时设立阴性对照。
DAB染色后， 苏木素复染、 中性树胶封片， 光镜下观察， 计数阳性细胞百分比。
1.2.6 造血祖细胞集落培养
(1) 混合集落形成细胞(CFU-Mix)培养每ml培养体系含2×105个骨髓单个核细胞、 0.3% 琼脂、 20% 的胎牛血清和1%牛血清白蛋白的IMDM以及细胞因子(2000 u/L EPO、 20 μg/L IL-3、20 μg/L GM-CSF)，置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养14天， 计数≥50个细胞为一个CFU。
(2) 粒–单细胞集落形成细胞(CFU-GM)培养每ml培养体系含2×105骨髓单个核细胞、 0.3% 琼脂、 20% 的胎牛血清的IMDM以及GM-CSF 1×105 u/L， 置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养14天， 计数≥40个细胞为一个CFU。
(3) 红系祖细胞(CFU-E)培养每ml培养体系含2×105个骨髓单个核细胞、 1.3%甲基纤维素、 20%的胎牛血清和1%牛血清白蛋白的IMDM以及EPO 200 u/L， 置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养14天， 计数≥50个细胞为一个CFU。
1.2.7 核酶基因转染慢性粒细胞白血病缓解模型 正常骨髓细胞与K562细胞以100∶1和1000∶1混合建立慢性粒细胞白血病缓解模型。 核酶pLRZSN转染按上述方法进行， 实验分2组：
第1组含1% K562细胞的正常骨髓细胞； 第2组含0.1% K562细胞的正常骨髓细胞。 同时转染pLXSN作为对照。
1.2.8 K562细胞集落培养 收集上述各组细胞， 按每ml培养体系含0.8%甲基纤维素、 10%胎牛血清的RPMI 1640、 1×104个骨髓单个核细胞， 置37 ℃、 5% CO2、 饱和湿度的培养箱中培养7天， 计数≥20个细胞为一个CFU。 同时用相同的体系培养正常骨髓细胞检验其在该培养体系是否形成集落。
1.2.9 巢式RT-PCR检测bcr/abl mRNA表达 收集上述各组细胞， 应用Trizol法（Life Technology公司）提取总RNA， cDNA合成及PCR扩增体系参照文献［10］， 试剂为Promega公司产品， PCR所用引物序列应用Oligo软件自行设计， 由上海生物工程公司合成。 巢式RT-PCR 扩增bcr/abl mRNA所用外引物上游序列为5′-GCAGATGCTGACCAACTCGT-3′,下游序列为5′-GATACTCAGCGGCATTGCG-3′， 扩增片段长度为484 bp,退火温度55 ℃； 内引物上游序列为 5′-ATGTCATCGTCCACTCAGC-3′，
下游序列为 5′-CTGTTGACTGGCGTGATGTA-3′， 扩增片段长度为324 bp， 退火温度53 ℃。 以扩增abl mRNA为内参照， 上游引物序列为5′-GAAGCCGCTCGTTGGAACTC-3′， 下游引物序列同内引物下游序列，
扩增片段长度为232 bp,退火温度56 ℃（见图2）。
PCR产物用凝胶图像分析仪(Bio-Rad)成像。
Fig.2 Model
showing the chimeric mRNA formed by bcr and abl genes that join together on
chromosome 22
The chimeric mRNA resulting from the B3A2
junction is shown. The first PCR B3A2 product (484 bp) was amplified by primer
A and B, which is complementary to a sequence on the abl exon 4 and bcr exon 2,
respectively. The second PCR B3A2 product (324 bp) was amplified by primer D
and E, which is complementary to a sequence on the abl exon 3 and bcr exon 3,
respectively. The internal control abl product (232 bp) was amplified by
primers C and D, which is complementary to a sequence on the abl exon 2 and 3,
respectively.
1.2.10 统计学分析 数据以x±s表示， 统计学分析用t检验。
2 结果(Results)
2.1 核酶对造血祖细胞生长增殖的影响
造血祖细胞集落分析表明核酶处理后，
原代慢性粒细胞白血病细胞生长增殖受明显抑制， 而对正常造血祖细胞影响较小，
见表1。
2.2 核酶对p210表达的影响
应用流式细胞仪检测发现核酶处理的原代慢性粒细胞白血病细胞p210的表达阳性率由处理前的92.6%±3.5%降至处理后的18.2%±0.4%， 而空载体pLXSN处理后p210的表达阳性率为90.4%±2.6%， 见图3。 说明原代慢性粒细胞白血病细胞经核酶处理后p210的表达受到明显抑制。 免疫组化显示同样结果（见图4）。
Table 1 The effect on progenitor cell growth of bone marrow cells transfected
with ribozyme
|
Plasmid |
CFU-Mix(%) |
CFU-GM(%) |
CFU-E(%) |
|||
|
CML |
Normal |
CML |
Normal |
CML |
Normal |
|
|
pLXSN |
2.5±2.1 |
2.7±1.6 |
2.8±1.9 |
3.5±2.6 |
3.5±2.6 |
5.5±2.4 |
|
pLRZSN |
82.3±12.6* |
6.3±2.2 |
83.5±11.5* |
8.9±3.2 |
88.9±14.6* |
12.3±4.6 |
Data represent the inhibitor rate of
progenitor cell growth of bone marrow from patient with CML or normal.
*P<0.01, compared with the group transfected with pLXSN.
Fig.3 Suppression of p210 in primary
CML bone marrow cells
Bone marrow mononuclear cells from patient
with CML with the B3A2 bcr-abl translocation were mock transduced (A) or
transduced with empty vector (B) or the retroviral vector expressing the
ribozyme (C), and analyzed p210 expression at 48 h after transduction. Shown
are the levels of p210 expressed by flow cytometry.
Fig.4 Suppression of p210 in primary CML bone
marrow cells
Bone marrow mononuclear cells from patient
with CML with the B3A2 bcr-abl translocation were mock transduced (A) or
transduced with empty vector (B) or the retroviral vector expressing the
ribozyme (C), and analyzed p210 expression at 48 h after transduction. Shown
are the levels of p210 expressed by immunocytochemical method.(original
magnification:×400)
2.3 核酶对模拟缓解骨髓的净化效果
正常骨髓单个核细胞在K562细胞培养体系中未能增殖， 因此， 该体系中形成的集落均为K562细胞。 在1%模拟缓解骨髓体系中， 核酶处理组K562细胞的集落形成抑制率为92.3%， 而空载体组仅为6.3%； 0.1%模拟缓解骨髓体系中， 核酶处理组K562细胞的集落形成抑制率为100%， 而空载体组为仅8.8%， 见表2。
Table 2 The effect of ribozyme on the growth of leukemic colony of K562
cells in bone marrow
|
Groups |
Colony |
|
|
1% K562 |
0.1% K562 |
|
|
Control |
72.8±4.2 |
6.8±0.4 |
|
pLXSN |
68.2±3.2# |
6.2±0.2# |
|
pLRZSN |
5.8±2.2* |
0* |
*P<0.01，
#P>0.01.
Fig.5 Nest RT-PCR analysis of purging of K562 cells in bone marrow by
ribozyme
(A) bcr/abl mRNA. M, pUC Mix marker 8; 1－3, bone marrow+1%K562; 4－6, bone marrow+0.1%K562. (B) abl
mRNA. 1 and 4, control; 2 and 5, pLXSN; 3 and 6, pLRZSN.
2.4 巢式RT-PCR检测核酶净化效果
应用巢式RT-PCR检测发现,无论1%模拟缓解骨髓还是0.1%模拟缓解骨髓均能检测出bcr/abl
mRNA特异性条带， 而核酶处理后两者均为阴性。
同时发现针对bcr/abl mRNA的核酶对abl mRNA表达没有影响， 见图5。
3 讨论(Discussion)
慢性粒细胞白血病（CML）是一种骨髓干细胞恶性增殖的克隆性疾病， 大约95% CML患者可检出费城染色体， 其分子生物学基础是bcr/abl融合基因， 后者在CML的发病中起重要作用。
异基因骨髓移植虽可根治CML， 但由于缺乏合适的供者和移植相关并发症的发生率及死亡率均高，
且治疗费用昂贵而受到限制。 自体骨髓移植是CML治疗有效方法之一， 但复发率高， 移植物中残留费城染色体阳性的细胞是导致复发的根源，
如能解决体外白血病细胞的净化问题则可望普及［11,12］。 通过特异性抑制bcr/abl融合基因的表达， 选择性抑制恶性细胞的增殖为骨髓净化提供了手段。 研究表明应用外源性的反义核酸或核酶可抑制bcr/abl mRNA 在费城染色体阳性细胞系和原代CML细胞表达［13,14］。 但抑制作用短暂， 相对于外源性的核酶而言， 在细胞内表达核酶可以提高其细胞内浓度延长作用时间。
另外， 所表达的核酶分子同细胞内RNA分子结合成更加稳定和适当构象， 有助于增强核酶的活性。 目前的应用研究多采用将核酶基因导入细胞，
使核酶在体内随着细胞的分裂而进行复制， 产生大量的核酶分子，
发挥切割活性。 现有研究表明在细胞内高水平表达核酶是行之有效的方法［15～17］。 Mendoza-Maldonado 等［6］研究表明针对bcr/abl mRNA的核酶同腺病毒VA1 RNA 或人U1 snRNA结合形成融合核酶， 通过逆转录病毒载体传递到费城染色体阳性细胞系和原代CML细胞内表达， 可显著下调bcr/abl mRNA及p210表达水平， 并诱导细胞凋亡，
但未进一步研究其体外净化骨髓作用。 我们曾将针对bcr/abl mRNA锤头状核酶通过逆转录病毒载体导入K562细胞， 取得类似的结果［7］。 锤头状核酶的骨髓净化效果如何，
国内外未见报道。 本研究首次将锤头状核酶用于体外模拟缓解骨髓的净化。
转导核酶进入细胞的载体有病毒载体和非病毒载体两类。
逆转录病毒介导的基因治疗是目前公认最安全有效的措施， 但由于其对原代骨髓细胞的转染效率较低，
因而限制其临床应用。 研究表明外源性的细胞因子及骨髓细胞外基质分子可以提高骨髓细胞的转染效率［18,19］。 本研究先用IL-3、 GM-CSF、 SCF刺激骨髓细胞，
并采用纤连蛋白包被的培养板转染骨髓细胞以提高病毒的转染效率， 结果表明逆转录病毒载体介导的核酶能够抑制原代CML骨髓细胞的增殖及抑制CML细胞p210的表达，
其未能完全抑制原因， 除了病毒上清液的转染效率达不到100%外， 可能由于骨髓细胞中尚存在一部分正常造血祖细胞，
同时也表明该核酶不影响正常造血祖细胞增殖。 进一步研究发现该核酶能抑制体外模拟缓解骨髓中残留K562细胞的增殖， 巢式RT-PCR检测该核酶可消除残留K562细胞bcr/abl mRNA表达， 但并不影响abl mRNA表达， 说明该核酶具有很强的序列特异性， 这也是其不影响正常造血祖细胞增殖的原因。
多年来， 人们对自体骨髓体外净化效果的评估一直持有争论，
其主要原因是缺乏有效而可靠的评估净化效果的检测手段。 应用免疫学、
细胞遗传学评价体外净化效果均不能发现少于1%～5%的微量残留白血病细胞（MRLC）。 本研究建立的巢式RT-PCR可以敏感快速、 特异检测MRLC达到10－3，
为自体骨髓体外净化效果的评估提供了检测手段。
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_______________________________________
Received: May 20, 2003 Accepted:
June 6, 2003
This work was supported by a grant from
Fujian Provincial Science Foundation (No. 97-Z-49)
*Corresponding author: Tel, 86-591-3351966;
e-mail, [email protected]